Abstract Variation in DNA methylation (DNAm) is associated with multiple biological processes that track growth and development, ageing and age-related diseases. However, there is little understanding of what constitutes typical patterns of DNAm variation and how these patterns change across the life course. In this study, we synthesised a map of the human methylome across the life course, focussing on changes in variability and mean DNAm. Harmonizing DNAm datasets across eight longitudinal and cross-sectional UK-based studies, we meta-analysed n=13,215 blood samples from n=7,037 unique individuals from birth to 98 years of age. Changes in CpG-specific variability and means were described across the life course using a meta-regression framework. CpG-specific associations of variability or mean DNAm in relation to the likelihood of association with 100 traits linked to environmental exposures, health and disease were tested within and across ten developmental age bins across the life course. Age was linked to DNAm variability at 29,212 CpG sites. On average, we observed a 1.26 fold increase in DNAm variability per year across the life course. 33,730 CpGs displayed changes in mean DNAm, with 64% of these loci showing decreases in DNAm over time. CpG sites linked to traits were in general more variable across the life course. Our study provides, for the first time, a map of the human methylome across the life course, which is publicly accessible through a searchable online database. This resource allows researchers to query CpG-specific trajectories from birth to old age and link these to health and disease.

ABSTRACT Attention-deficit and hyperactivity disorder (ADHD) is a common childhood disorder with a substantial genetic component. However, the extent to which epigenetic mechanisms play a role in the etiology of the disorder is not known. We performed epigenome-wide association studies (EWAS) within the Pregnancy And Childhood Epigenetics (PACE) Consortium to identify DNA methylation sites associated with ADHD symptoms at two methylation assessment periods: birth and school-age. We examined associations of DNA methylation in cord blood with repeatedly assessed ADHD symptoms (age range 4-15 years) in 2477 children from five cohorts and DNA methylation at school-age with concurrent ADHD symptoms (age 7-11 years) in 2374 children from ten cohorts. CpGs identified with nominal significance (p<0.05) in either of the EWAS were correlated between timepoints (ρ=0.30), suggesting overlap in associations, however, top signals were very different. At birth, we identified nine CpGs that were associated with later ADHD symptoms (P<1*10 −7 ), including ERC2 and CREB5. Peripheral blood DNA methylation at one of these CpGs (cg01271805 located in the promotor region of ERC2, which regulates neurotransmitter release) was previously associated with brain methylation. Another (cg25520701) lies within the gene body of CREB5, which was associated with neurite outgrowth and an ADHD diagnosis in previous studies. In contrast, at school-age, no CpGs were associated with ADHD with P<1*10 −7 . In conclusion, we found evidence in this study that DNA methylation at birth is associated with ADHD. Future studies are needed to confirm the utility of methylation variation as biomarker and its involvement in causal pathways.

Abstract Background Evidence for aspirin’s chemopreventative properties on colorectal cancer (CRC) is substantial, but its mechanism of action is not well-understood. We combined a proteomic approach with Mendelian randomization (MR) to identify possible new aspirin targets that decrease CRC risk. Methods Human colorectal adenoma cells (RG/C2) were treated with aspirin (24 hours) and a stable isotope labelling with amino acids in cell culture (SILAC) based proteomics approach identified altered protein expression. Protein quantitative trait loci (pQTLs) from INTERVAL (N=3,301) and expression QTLs (eQTLs) from the eQTLGen Consortium (N=31,684) were used as genetic proxies for protein and mRNA expression levels. Two-sample MR of mRNA/protein expression on CRC risk was performed using eQTL/pQTL data combined with CRC genetic summary data from the Colon Cancer Family Registry (CCFR), Colorectal Transdisciplinary (CORECT), Genetics and Epidemiology of Colorectal Cancer (GECCO) consortia and UK Biobank (55,168 cases and 65,160 controls). Results Altered expression was detected for 125/5886 proteins. Of these, aspirin decreased MCM6, RRM2 and ARFIP2 expression and MR analysis showed that a standard deviation increase in mRNA/protein expression was associated with increased CRC risk (OR:1.08, 95% CI:1.03-1.13, OR:3.33, 95% CI:2.46-4.50 and OR:1.15, 95% CI:1.02-1.29, respectively). Conclusion MCM6 and RRM2 are involved in DNA repair whereby reduced expression may lead to increased DNA aberrations and ultimately cancer cell death, whereas ARFIP2 is involved in actin cytoskeletal regulation indicating a possible role in aspirin’s reduction of metastasis. Impact Our approach has shown how laboratory experiments and population-based approaches can combine to identify aspirin-targeted proteins possibly affecting CRC risk.

Elevated C-reactive protein (CRP) levels are an indicator of chronic low-grade inflammation. Epigenetic modifications, including DNA methylation, have been linked to CRP, but systematic investigations into potential underlying causal relationships have not yet been performed. We systematically performed two-sample Mendelian randomization and colocalization analysis between CRP and DNA methylation levels, using GWAS and EWAS summary statistics as well as individual level data available through the ARIES subset of the Avon Longitudinal Study of Parents and Children (ALSPAC; 1,616 participants). We found no convincing examples for a causal association from CRP to DNA methylation. Testing for the reverse (a putative causal effect of DNA methylation on CRP), we found three CpG sites that had shared genetic effects with CRP levels after correcting for multiple testing (cg26470501 (offspring: beta=0.07 [0.03, 0.11]; mothers: beta=0.08 [0.04, 0.13]), cg27023597 (offspring: beta=0.18 [0.10, 0.25]; mothers: beta=0.20 [0.12, 0.28]) and cg12054453 (offspring: beta=0.09 [0.05, 0.13])) influenced CRP levels. For all three CpG sites, linked to the genes TMEM49, BCL3 and MIR21, increased methylation related to an increase in CRP levels. Two CpGs (cg27023597 and cg12054453) were influenced by SNPs in genomic regions that had not previously been implicated in CRP GWASs, implicating them as novel genetic associations. Overall, our findings suggest that CRP associations with DNA methylation are more likely to be driven by either confounding or causal influences of DNA methylation on CRP levels, rather than the reverse.

Background Given clear evidence that smoking lowers weight, it is possible that individuals with higher body mass index (BMI) smoke in order to lose or maintain their weight. Methods and Findings We undertook Mendelian randomization analyses using 97 genetic variants associated with BMI. We performed two sample Mendelian randomization analyses of the effects of BMI on smoking behaviour in UK Biobank (N=335,921) and the Tobacco and Genetics consortium genomewide association study (GWAS) (N≤74,035) respectively, and two sample Mendelian randomization analyses of the effects of BMI on cotinine levels (N≤4,548) and nicotine metabolite ratio (N≤1,518) in published GWAS, and smoking-related DNA methylation in the Avon Longitudinal Study of Parents and Children (N≤846). In inverse variance weighted Mendelian randomization analysis, there was evidence that higher BMI was causally associated with smoking initiation (OR for ever vs never smoking per one SD increase in BMI: 1.19, 95% CI: 1.11 to 1.27) and smoking heaviness (1.45 additional cigarettes smoked per day per SD increase in BMI, 95% CI: 1.03 to 1.86), but little evidence for a causal effect with smoking cessation. Results were broadly similar using pleiotropy robust methods (MR-Egger, median and weighted mode regression). These results were supported by evidence for a causal effect of BMI on DNA methylation at the aryl-hydrocarbon receptor repressor (AHRR) locus. There was no strong evidence that BMI was causally associated with cotinine, but suggestive evidence for a causal negative association with the nicotine metabolite ratio. Conclusions There is a causal bidirectional association between BMI and smoking, but the relationship is likely to be complex due to opposing effects on behaviour and metabolism. It may be useful to consider BMI and smoking together when designing prevention strategies to minimise the effects of these risk factors on health outcomes.

Genomic imprinting is an epigenetic mechanism leading to parent-of-origin dependent gene expression. So far, the precise number of imprinted genes in humans is uncertain. In this study, we leveraged genome-wide DNA methylation in whole blood measured longitudinally at 3 time points (birth, childhood and adolescence) and GWAS data in 740 Mother-Child duos from the Avon Longitudinal Study of Parents and Children (ALSPAC) to systematically identify imprinted loci. We reasoned that cis-meQTLs at genomic regions that were imprinted would show strong evidence of parent-of-origin associations with DNA methylation, enabling the detection of imprinted regions. Using this approach, we identified genome-wide significant cis-meQTLs that exhibited parent-of-origin effects (POEs) at 35 novel and 50 known imprinted regions (10-10 < P < 10-300). Among the novel loci, we observed signals near genes implicated in cardiovascular disease (PCSK9), and Alzheimer's disease (CR1), amongst others. Most of the significant regions exhibited imprinting patterns consistent with uniparental expression, with the exception of twelve loci (including the IGF2, IGF1R, and IGF2R genes), where we observed a bipolar-dominance pattern. POEs were remarkably consistent across time points and were so strong at some loci that methylation levels enabled good discrimination of parental transmissions at these and surrounding genomic regions. The implication is that parental allelic transmissions could be modelled at many imprinted (and linked) loci and hence POEs detected in GWAS of unrelated individuals given a combination of genetic and methylation data. Our results indicate that modelling POEs on DNA methylation is effective to identify loci that may be affected by imprinting.

Background Various modifiable risk factors have been associated with epithelial ovarian cancer risk in observational epidemiological studies. However, the causal nature of the risk factors reported, and thus their suitability as effective intervention targets, is unclear given the susceptibility of conventional observational designs to residual confounding and reverse causation. Mendelian randomization uses genetic variants as proxies for modifiable risk factors to strengthen causal inference in observational studies. We used Mendelian randomization to evaluate the causal role of 13 previously reported risk factors (reproductive, anthropometric, clinical, lifestyle, and molecular factors) in overall and histotype-specific epithelial ovarian cancer in up to 25,509 case subjects and 40,941 controls in the Ovarian Cancer Association Consortium.Methods and Findings Genetic instruments to proxy 13 risk factors were constructed by identifying single nucleotide polymorphisms (SNPs) robustly ( P <5×10−8) and independently associated with each respective risk factor in previously reported genome-wide association studies. SNPs were combined into multi-allelic inverse-variance weighted fixed or random-effects models to generate causal estimates. Three complementary sensitivity analyses were performed to examine violations of Mendelian randomization assumptions: MR-Egger regression and weighted median and mode estimators. A Bonferroni-corrected P -value threshold was used to establish “strong evidence” ( P <0.0038) and “suggestive evidence” (0.0038< P <0.05) for associations.In Mendelian randomization analyses, there was strong or suggestive evidence that 9 of 13 risk factors had a causal effect on overall or histotype-specific epithelial ovarian cancer. There was strong evidence that genetic liability to endometriosis increased risk of epithelial ovarian cancer (OR per log odds higher liability:1.27, 95% CI: 1.16-1.40; P =6.94×10−7) and suggestive evidence that lifetime smoking exposure increased risk of epithelial ovarian cancer (OR per unit increase in smoking score:1.36, 95% CI: 1.04-1.78; P =0.02). In histotype-stratified analyses, the strongest associations found were between: height and clear cell carcinoma (OR per SD increase:1.36, 95% CI: 1.15-1.61; P =0.0003); age at natural menopause and endometrioid carcinoma (OR per year later onset:1.09, 95% CI: 1.02-1.16; P =0.007); and genetic liability to polycystic ovary syndrome and endometrioid carcinoma (OR per log odds higher liability:0.74, 95% CI:0.62-0.90; P =0.002). There was little evidence for an effect of genetic liability to type 2 diabetes, parity, or circulating levels of 25-hydroxyvitamin D and sex hormone-binding globulin on ovarian cancer or its subtypes. The primary limitations of this analysis include: modest statistical power for analyses of risk factors in relation to some less common ovarian cancer histotypes (low grade serous, mucinous, and clear cell carcinomas), the inability to directly examine the causal effects of some ovarian cancer risk factors that did not have robust genetic variants available to serve as proxies (e.g., oral contraceptives, hormone replacement therapy), and the assumption of linear relationships between risk factors and ovarian cancer risk.Conclusions Our comprehensive examination of possible etiological drivers of ovarian carcinogenesis using germline genetic variants to proxy risk factors supports a causal role for few of these factors in epithelial ovarian cancer and suggests distinct etiologies across histotypes. The identification of novel modifiable risk factors remains an important priority for the control of epithelial ovarian cancer.

Observational epidemiological studies are prone to confounding, measurement error, and reverse causation, undermining their ability to generate reliable causal estimates of the effect of risk factors to inform cancer prevention and treatment strategies. Mendelian randomization (MR) is an analytical approach that uses genetic variants to proxy potentially modifiable exposures (e.g. environmental factors, biological traits, and druggable pathways) to permit robust causal inference of the effects of these exposures on diseases and their outcomes. MR has seen widespread adoption within population health research in cardio-metabolic disease, but also holds much promise for identifying possible interventions (e.g., dietary, behavioural, or pharmacological) for cancer prevention and treatment. However, some methodological and conceptual challenges in the implementation of MR are particularly pertinent when applying this method to cancer aetiology and prognosis, including reverse causation arising from disease latency and selection bias in studies of cancer progression. These issues must be carefully considered to ensure appropriate design, analysis, and interpretation of such studies. In this review, we provide an overview of the key principles and assumptions of MR focusing on applications of this method to the study of cancer aetiology and prognosis. We summarize recent studies in the cancer literature that have adopted a MR framework to highlight strengths of this approach compared to conventional epidemiological studies. Lastly, limitations of MR and recent methodological developments to address them are discussed, along with the translational opportunities they present to inform public health and clinical interventions in cancer.

Prenatal cigarette smoke is an environmental stressor that has a profound effect on DNA methylation in the exposed offspring. We have previously shown that some of these effects persist throughout childhood and into adolescence. Of interest is whether these signals persist into adulthood. We conducted an analysis to investigate associations between reported maternal smoking in pregnancy and DNA methylation in peripheral blood of women in the Avon Longitudinal Study of Parents and Children (ALSPAC) (n=754; mean age 30 years). We observed associations at 15 CpG sites in 11 gene regions, MYO1G, FRMD4A, CYP1A1, CNTNAP2, ARL4C, AHRR, TIFAB, MDM4, AX748264, DRD1, FTO (FDR < 5%). All but two of these CpG sites have previously been identified in relation to prenatal smoke exposure in the offspring at birth and the majority showed persistent hypermethylation among the offspring of smokers. We confirmed that most of these associations were not driven by own smoking and that they were still present 18 years later (N = 656; mean age 48 years). In addition, we replicated findings of a persistent methylation signal related to prenatal smoke exposure in peripheral blood among men in the ALSPAC cohort (N = 230; mean age 53 years). For both participant groups, there was a strong signal of association above that expected by chance at CpG sites previously associated with prenatal smoke exposure in newborns (Wilcoxon rank sum p-value < 2.2 x 10-4). Furthermore, we found that a prenatal smoking score, derived by combining methylation values at these CpG sites, could predict whether the mothers of the ALSPAC women smoked during pregnancy with an AUC 0.69 (95% 0.67, 0.73).

We have undertaken an extensive Mendelian randomization (MR) study using methylation quantitative trait loci (mQTL) as genetic instruments to assess the potential causal relationship between genetic variation, DNA methylation and 139 complex traits. Using two-sample MR, we observed 1,191 effects across 62 traits where genetic variants were associated with both proximal DNA methylation (i.e. cis-mQTL) and complex trait variation (P<1.39x10-08). Joint likelihood mapping provided evidence that the causal mQTL for 364 of these effects across 58 traits was also likely the causal variant for trait variation. These effects showed a high rate of replication in the UK Biobank dataset for 14 selected traits, as 121 of the attempted 129 effects replicated. Integrating expression quantitative trait loci (eQTL) data suggested that genetic variants responsible for 319 of the 364 mQTL effects also influence gene expression, which indicates a coordinated system of effects that are consistent with causality. CpG sites were enriched for histone mark peaks in tissue types relevant to their associated trait and implicated genes were enriched across relevant biological pathways. Though we are unable to distinguish mediation from horizontal pleiotropy in these analyses, our findings should prove valuable in identifying candidate loci for further evaluation and help develop mechanistic insight into the aetiology of complex disease.