The emergence of SARS-CoV-2 variants poses greater challenges to the control of COVID-19 pandemic. Here, we parallelly investigated three important characteristics of seven SARS-CoV-2 variants, including two mink-associated variants, the B.1.617.1 variant, and the four WHO-designated variants of concerns (B.1.1.7, B.1.351, P.1, and B.1.617.2). We first investigated the ability of these variants to bind and use animal ACE2 orthologs as entry receptor. We found that, in contrast to a prototype variant, the B.1.1.7, B.1.351, and P.1 variants had significantly enhanced affinities to cattle, pig, and mouse ACE2 proteins, suggesting increased susceptibility of these species to these SARS-CoV-2 variants. We then evaluated in vitro neutralization sensitivity of these variants to four monoclonal antibodies in clinical use. We observed that all the variants were partially or completely resistant against at least one of the four tested antibodies, with B.1.351 and P.1 showing significant resistance to three of them. As ACE2-Ig is a broad-spectrum anti-SARS-CoV-2 drug candidate, we then evaluated in vitro neutralization sensitivity of these variants to eight ACE2-Ig constructs previously described in three different studies. All the SARS-CoV-2 variants were efficiently neutralized by these ACE2-Ig constructs. Interestingly, compared to the prototype variant, most tested variants including the variants of concern B.1.1.7, B.1.351, P.1, and B.1.617.2 showed significantly increased (up to ~15-fold) neutralization sensitivity to ACE2-Ig constructs that are not heavily mutated in the spike-binding interface of the soluble ACE2 domain, suggesting that SARS-CoV-2 evolves toward better utilizing ACE2, and that ACE2-Ig is an attractive drug candidate for coping with SARS-CoV-2 mutations.

ABSTRACT Recently, highly transmissible SARS-CoV-2 variants B.1.617.1 (Kappa), B.1.617.2 (Delta) and B.1.618 were identified in India with mutations within the spike proteins. The spike protein of Kappa contains four mutations E154K, L452R, E484Q and P681R, and Delta contains L452R, T478K and P681R, while B.1.618 spike harbors mutations Δ145-146 and E484K. However, it remains unknown whether these variants have altered in their entry efficiency, host tropism, and sensitivity to neutralizing antibodies as well as entry inhibitors. In this study, we found that Kappa, Delta or B.1.618 spike uses human ACE2 with no or slightly increased efficiency, while gains a significantly increased binding affinity with mouse, marmoset and koala ACE2 orthologs, which exhibits limited binding with WT spike. Furthermore, the P618R mutation leads to enhanced spike cleavage, which could facilitate viral entry. In addition, Kappa, Delta and B.1.618 exhibits a reduced sensitivity to neutralization by convalescent sera owning to the mutation of E484Q, T478K, Δ145-146 or E484K, but remains sensitive to entry inhibitors-ACE2-lg decoy receptor. Collectively, our study revealed that enhanced human and mouse ACE2 receptor engagement, increased spike cleavage and reduced sensitivity to neutralization antibodies of Kappa, Delta and B.1.618 may contribute to the rapid spread of these variants and expanded host range. Furthermore, our result also highlighted that ACE2-lg could be developed as broad-spectrum antiviral strategy against SARS-CoV-2 variants.

Abstract COVID-19 patients transmitted SARS-CoV-2 to minks in the Netherlands in April 2020. Subsequently, the mink-associated virus (miSARS-CoV-2) spilled back over into humans. Genetic sequences of the miSARS-CoV-2 identified a new genetic variant known as “Cluster 5” that contained mutations in the spike protein. However, the functional properties of these “Cluster 5” mutations have not been well established. In this study, we found that the Y453F mutation located in the RBD domain of miSARS-CoV-2 is an adaptive mutation that enhances binding to mink ACE2 and other orthologs of Mustela species without compromising, and even enhancing, its ability to utilize human ACE2 as a receptor for entry. Structural analysis suggested that despite the similarity in the overall binding mode of SARS-CoV-2 RBD to human and mink ACE2, Y34 of mink ACE2 was better suited to interact with a Phe rather than a Tyr at position 453 of the viral RBD due to less steric clash and tighter hydrophobic-driven interaction. Additionally, the Y453F spike exhibited resistance to convalescent serum, posing a risk for vaccine development. Thus, our study suggests that since the initial transmission from humans, SARS-CoV-2 evolved to adapt to the mink host, leading to widespread circulation among minks while still retaining its ability to efficiently utilize human ACE2 for entry, thus allowing for transmission of the miSARS-CoV-2 back into humans. These findings underscore the importance of active surveillance of SARS-CoV-2 evolution in Mustela species and other susceptible hosts in order to prevent future outbreaks.

The SARS-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike (S) protein mediates viral entry into cells expressing the angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2). The S protein engages ACE2 through its receptor-binding domain (RBD), an independently folded 197-amino acid fragment of the 1273-amino acid S-protein protomer. The RBD is the primary SARS-CoV-2 neutralizing epitope and a critical target of any SARS-CoV-2 vaccine. Here we show that this RBD conjugated to each of two carrier proteins elicited more potent neutralizing responses in immunized rodents than did a similarly conjugated proline-stabilized S-protein ectodomain. Nonetheless, the native RBD expresses inefficiently, limiting its usefulness as a vaccine antigen. However, we show that an RBD engineered with four novel glycosylation sites (gRBD) expresses markedly more efficiently, and generates a more potent neutralizing responses as a DNA vaccine antigen, than the wild-type RBD or the full-length S protein, especially when fused to multivalent carriers such as an H. pylori ferritin 24-mer. Further, gRBD is more immunogenic than the wild-type RBD when administered as a subunit protein vaccine. Our data suggest that multivalent gRBD antigens can reduce costs and doses, and improve the immunogenicity, of all major classes of SARS-CoV-2 vaccines.

Abstract As SARS-CoV-2 variants have been causing increasingly serious drug resistance problem, development of broadly effective and hard-to-escape anti-SARS-CoV-2 agents is in urgent need. Here we describe further development and characterization of two SARS-CoV-2 receptor decoy proteins, ACE2-Ig-95 and ACE2-Ig-105/106. We found that both proteins had potent and robust in vitro neutralization activities against diverse SARS-CoV-2 variants including Omicron, with an average IC 50 of up to 37 pM. In a stringent lethal SARS-CoV-2 infection mouse model, both proteins lowered lung viral load by up to ∼1000 fold, prevented the emergence of clinical signs in >75% animals, and increased animal survival rate from 0% (untreated) to >87.5% (treated). These results demonstrate that both proteins are good drug candidates for protecting animals from severe COVID-19. In a head-to-head comparison of these two proteins with five previously-described ACE2-Ig constructs, we found that two of these constructs, each carrying five surface mutations in the ACE2 region, had partial loss of neutralization potency against three SARS-CoV-2 variants. These data suggest that extensively mutating ACE2 residues near the RBD-binding interface should be avoided or performed with extra caution. Further, we found that both ACE2-Ig-95 and ACE2-Ig-105/106 could be produced to gram/liter level, demonstrating the developability of them as biologic drug candidates. Stress-condition stability test of them further suggests that more studies are required in the future to improve the stability of these proteins. These studies provide useful insight into critical factors for engineering and preclinical development of ACE2 decoys as broadly effective therapeutics against diverse ACE2-utilizing coronaviruses. Abstract Importance Engineering soluble ACE2 proteins that function as a receptor decoy to block SARS-CoV-2 infection is a very attractive approach to broadly effective and hard-to-escape anti-SARS-CoV-2 agents. This study here describes development of two antibody-like soluble ACE2 proteins that broadly block diverse SARS-CoV-2 variants including Omicron. In a stringent COVID-19 mouse model, both proteins successfully protected >87.5% animals from lethal SARS-CoV-2 infection. In addition, a head-to-head comparison of the two constructs developed in this study with five previously-described ACE2 decoy constructs were performed here. Two previously-described constructs with relatively more ACE2-surface mutations were found with less robust neutralization activities against diverse SARS-CoV-2 variants. Further, the developability of the two proteins as biologic drug candidates was also assessed here. This study provides two broadly anti-SARS-CoV-2 drug candidates and useful insight into critical factors for engineering and preclinical development of ACE2 decoy as broadly effective therapeutics against diverse ACE2-utilizing coronaviruses. Tweet Two antibody-like ACE2 decoy proteins could block diverse SARS-CoV-2 variants and prevent animals from severe COVID-19.

Abstract B cells have been engineered ex vivo to express an HIV-1 broadly neutralizing antibody (bNAb). B-cell reprograming may be scientifically and therapeutically useful, but current approaches limit B-cell repertoire diversity and disrupt the organization of the heavy-chain locus. A more diverse and physiologic B-cell repertoire targeting a key HIV-1 epitope could facilitate evaluation of vaccines designed to elicit bNAbs, help identity more potent and bioavailable bNAb variants, or directly enhance viral control in vivo . Here we address the challenges of generating such a repertoire by replacing the heavy-chain CDR3 (HCDR3) regions of primary human B cells. To do so, we identified and utilized an uncharacterized Cas12a ortholog that recognizes PAM motifs present in human JH genes. We also optimized the design of 200 nucleotide homology-directed repair templates (HDRT) by minimizing the required 3’-5’ deletion of the HDRT-complementary strand. Using these techniques, we edited primary human B cells to express a hemagglutinin epitope tag and the HCDR3 regions of the bNAbs PG9 and CH01. Those edited with bNAb HCDR3 efficiently bound trimeric HIV-1 antigens, implying they could affinity mature in vivo in response to the same antigens. This approach generates diverse B-cell repertoires recognizing a key HIV-1 neutralizing epitope.

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is a currently uncontrolled pandemic and the etiological agent of coronavirus disease 2019 (COVID-19). It is important to study the host range of SARS-CoV-2 because some domestic species might harbor the virus and transmit it back to humans. In addition, insight into the ability of SARS-CoV-2 and SARS-like viruses to utilize animal orthologs of the SARS-CoV-2 receptor ACE2 might provide structural insight into improving ACE2-based viral entry inhibitors. Here we show that ACE2 orthologs of a wide range of domestic and wild animals support entry of SARS-CoV-2, as well as that of SARS-CoV-1, bat coronavirus RaTG13, and a coronavirus isolated from pangolins. Some of these species, including camels, cattle, horses, goats, sheep, pigs, cats, and rabbits may serve as potential intermediate hosts for new human transmission, and rabbits in particular may serve as a useful experimental model of COVID-19. We show that SARS-CoV-2 and SARS-CoV-1 entry could be potently blocked by recombinant IgG Fc-fusion proteins of viral spike protein receptor-binding domains (RBD-Fc) and soluble ACE2 (ACE2-Fc). Moreover, an ACE2-Fc variant, which carries a D30E mutation and has ACE2 truncated at its residue 740 but not 615, outperforms all the other ACE2-Fc variants on blocking entry of both viruses. Our data suggest that RBD-Fc and ACE2-Fc could be used to treat and prevent infection of SARS-CoV-2 and any new viral variants that emerge over the course of the pandemic.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

The SARS-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike (S) protein mediates entry of SARS-CoV-2 into cells expressing the angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2). The S protein engages ACE2 through its receptor-binding domain (RBD), an independently folded 197-amino acid fragment of the 1273-amino acid S-protein protomer. Antibodies to the RBD domain of SARS-CoV (SARS-CoV-1), a closely related coronavirus which emerged in 2002-2003, have been shown to potently neutralize SARS-CoV-1 S-protein-mediated entry, and the presence of anti-RBD antibodies correlates with neutralization in SARS-CoV-2 convalescent sera. Here we show that immunization with the SARS-CoV-2 RBD elicits a robust neutralizing antibody response in rodents, comparable to 100 μg/ml of ACE2-Ig, a potent SARS-CoV-2 entry inhibitor. Importantly, anti-sera from immunized animals did not mediate antibody-dependent enhancement (ADE) of S-protein-mediated entry under conditions in which Zika virus ADE was readily observed. These data suggest that an RBD-based vaccine for SARS-CoV-2 could be safe and effective.