Multiple cellular stressors, including activation of the tumour suppressor p53, can stimulate autophagy. Here we show that deletion, depletion or inhibition of p53 can induce autophagy in human, mouse and nematode cells subjected to knockout, knockdown or pharmacological inhibition of p53. Enhanced autophagy improved the survival of p53-deficient cancer cells under conditions of hypoxia and nutrient depletion, allowing them to maintain high ATP levels. Inhibition of p53 led to autophagy in enucleated cells, and cytoplasmic, not nuclear, p53 was able to repress the enhanced autophagy of p53−/− cells. Many different inducers of autophagy (for example, starvation, rapamycin and toxins affecting the endoplasmic reticulum) stimulated proteasome-mediated degradation of p53 through a pathway relying on the E3 ubiquitin ligase HDM2. Inhibition of p53 degradation prevented the activation of autophagy in several cell lines, in response to several distinct stimuli. These results provide evidence of a key signalling pathway that links autophagy to the cancer-associated dysregulation of p53.

The relative contributions of apoptosis and necrosis in brain injury have been a matter of much debate. Caspase-3 has been identified as a key protease in the execution of apoptosis, whereas calpains have mainly been implicated in excitotoxic neuronal injury. In a model of unilateral hypoxia-ischemia in 7-day-old rats, caspase-3-like activity increased 16-fold 24 h postinsult, coinciding with cleavage of the caspase-3 proenzyme and endogenous caspase-3 substrates. This activation was significantly decreased by pharmacological calpain inhibition, using CX295, a calpain inhibitor that did not inhibit purified caspase-3 in vitro. Activation of caspase-3 by m-calpain, but not μ-calpain, was facilitated in a dose-dependent manner in vitroby incubating cytosolic fractions, containing caspase-3 proform, with calpains. This facilitation required the presence of some active caspase-3 and could be abolished by including the specific calpain inhibitor calpastatin. This indicates that initial cleavage of caspase-3 by m-calpain, producing a 29-kDa fragment, facilitates the subsequent cleavage into active forms. This is the first report to our knowledge suggesting a direct link between the early, excitotoxic, calcium-mediated activation of calpain after cerebral hypoxia-ischemia and the subsequent activation of caspase-3, thus representing a tentative pathway of “pathological apoptosis.” The relative contributions of apoptosis and necrosis in brain injury have been a matter of much debate. Caspase-3 has been identified as a key protease in the execution of apoptosis, whereas calpains have mainly been implicated in excitotoxic neuronal injury. In a model of unilateral hypoxia-ischemia in 7-day-old rats, caspase-3-like activity increased 16-fold 24 h postinsult, coinciding with cleavage of the caspase-3 proenzyme and endogenous caspase-3 substrates. This activation was significantly decreased by pharmacological calpain inhibition, using CX295, a calpain inhibitor that did not inhibit purified caspase-3 in vitro. Activation of caspase-3 by m-calpain, but not μ-calpain, was facilitated in a dose-dependent manner in vitroby incubating cytosolic fractions, containing caspase-3 proform, with calpains. This facilitation required the presence of some active caspase-3 and could be abolished by including the specific calpain inhibitor calpastatin. This indicates that initial cleavage of caspase-3 by m-calpain, producing a 29-kDa fragment, facilitates the subsequent cleavage into active forms. This is the first report to our knowledge suggesting a direct link between the early, excitotoxic, calcium-mediated activation of calpain after cerebral hypoxia-ischemia and the subsequent activation of caspase-3, thus representing a tentative pathway of “pathological apoptosis.” hypoxia-ischemia aminomethylcoumarin DNA fragmentation factor 45 α-fodrin breakdown product inhibitor of caspase-activated DNase poly(ADP-ribose) polymerase dithiothreitol 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethyl ketone t-butoxycarbonyl-Asp-(OMe)-fluoromethyl ketone phosphate-buffered saline polymerase chain reaction glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Leu-Tyr-AMC The relative contributions of necrosis and apoptosis to the injury that develops after cerebral hypoxia-ischemia (HI)1 has been a matter of much debate (1Lee J.M. Zipfel G.J. Choi D.W. Nature. 1999; 399: 7-14Crossref PubMed Scopus (1004) Google Scholar). Recent studies suggest that cell death after HI is different from developmentally regulated cell death in most cases and cannot appropriately be described as apoptotic (2MacManus J.P. Fliss H. Preston E. Rasquinha I. Tuor U. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1999; 19: 502-510Crossref PubMed Scopus (38) Google Scholar, 3Jin K. Chen J. Nagayama T. Chen M. Sinclair J. Graham S.H. Simon R.P. J. Neurochem. 1999; 72: 1204-1214Crossref PubMed Scopus (69) Google Scholar, 4Ishimaru M.J. Ikonomidou C. Tenkova T.I. Der T.C. Dikranian K. Sesma M.A. Olney J.W. J. Comp. Neurol. 1999; 408: 461-476Crossref PubMed Scopus (188) Google Scholar, 5Portera-Cailliau C. Price D.L. Martin L.J. J. Comp. Neurol. 1997; 378: 70-87PubMed Google Scholar). Nevertheless, HI cell death shares important morphological and biochemical features with apoptotic cell death, such as activation of caspases and nucleosomal DNA fragmentation (6Zhu C. Wang X. Hagberg H. Blomgren K. J. Neurochem. 2000; 75: 819-829Crossref PubMed Scopus (111) Google Scholar, 7Linnik M.D. Zobrist R.H. Hatfield M.D. Stroke. 1993; 24: 2002-2008Crossref PubMed Scopus (675) Google Scholar, 8MacManus J.P. Buchan A.M. Hill I.E. Rasquinha I. Preston E. Neurosci. Lett. 1993; 164: 89-92Crossref PubMed Scopus (450) Google Scholar, 9Cheng Y. Deshmukh M. DaCosta A. Demaro J.A. Gidday J.M. Shah A. Sun Y. Jacquin M.F. Johnson E.M. Holtzman D.M. J. Clin. Invest. 1998; 101: 1992-1999Crossref PubMed Scopus (481) Google Scholar, 10Namura S. Zhu J. Fink K. Endres M. Srinivasan A. Tomaselli K.J. Yuan J. Moskowitz M.A. J. Neurosci. 1998; 18: 3659-3668Crossref PubMed Google Scholar, 11Chen J. Nagayama T. Jin K. Stetler R.A. Zhu R.L. Graham S.H. Simon R.P. J. Neurosci. 1998; 18: 4914-4928Crossref PubMed Google Scholar, 12Pulera M.R. Adams L.M. Liu H. Santos D.G. Nishimura R.N. Yang F. Cole G.M. Wasterlain C.G. Stroke. 1998; 29: 2622-2630Crossref PubMed Scopus (180) Google Scholar, 13Ni B. Wu X. Su Y. Stephenson D. Smalstig E.B. Clemens J. Paul S.M. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1998; 18: 248-256Crossref PubMed Scopus (147) Google Scholar, 14Ma J. Endres M. Moskowitz M.A. Br. J. Pharmacol. 1998; 124: 756-762Crossref PubMed Scopus (156) Google Scholar, 15Endres M. Namura S. Shimizu-Sasamata M. Waeber C. Zhang L. Gomez-Isla T. Hyman B.T. Moskowitz M.A. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1998; 18: 238-247Crossref PubMed Scopus (509) Google Scholar, 16Hara H. Friedlander R.M. Gagliardini V. Ayata C. Fink K. Huang Z. Shimizu-Sasamata M. Yuan J. Moskowitz M.A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 2007-2012Crossref PubMed Scopus (798) Google Scholar, 17Yue X. Mehmet H. Penrice J. Cooper C. Cady E. Wyatt J.S. Reynolds E.O. Edwards A.D. Squier M.V. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 1997; 23: 16-25Crossref PubMed Scopus (177) Google Scholar). Caspases, a family of cysteine proteases with an unusual substrate specificity, requiring an aspartate residue in the P1 position, have been identified as key executors of apoptosis (18Stennicke H.R. Salvesen G.S. Biochim. Biophys. Acta. 2000; 1477: 299-306Crossref PubMed Scopus (295) Google Scholar). Calpains, another family of cysteine proteases, are calcium-activated and are proposed to participate in the turnover of cytoskeletal proteins and regulation of kinases, transcription factors, and receptors (19Chan S.L. Mattson M.P. J. Neurosci. Res. 1999; 58: 167-190Crossref PubMed Scopus (372) Google Scholar, 20Sorimachi H. Ishiura S. Suzuki K. Biochem. J. 1997; 328: 721-732Crossref PubMed Scopus (620) Google Scholar). Calpains have mainly been implicated in excitotoxic neuronal injury and necrosis (21Seubert P. Lee K. Lynch G. Brain Res. 1989; 492: 366-370Crossref PubMed Scopus (189) Google Scholar, 22Siman R. Noszek J. Neuron. 1988; 1: 279-287Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (381) Google Scholar, 23Bednarski E. Vanderklish P. Gall C. Saido T. Bahr B. Lynch G. Brain Res. 1995; 694: 147-157Crossref PubMed Scopus (61) Google Scholar). Pharmacological inhibitors of calpains and caspases exert cerebroprotective effects (9Cheng Y. Deshmukh M. DaCosta A. Demaro J.A. Gidday J.M. Shah A. Sun Y. Jacquin M.F. Johnson E.M. Holtzman D.M. J. Clin. Invest. 1998; 101: 1992-1999Crossref PubMed Scopus (481) Google Scholar, 14Ma J. Endres M. Moskowitz M.A. Br. J. Pharmacol. 1998; 124: 756-762Crossref PubMed Scopus (156) Google Scholar, 15Endres M. Namura S. Shimizu-Sasamata M. Waeber C. Zhang L. Gomez-Isla T. Hyman B.T. Moskowitz M.A. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1998; 18: 238-247Crossref PubMed Scopus (509) Google Scholar, 16Hara H. Friedlander R.M. Gagliardini V. Ayata C. Fink K. Huang Z. Shimizu-Sasamata M. Yuan J. Moskowitz M.A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 2007-2012Crossref PubMed Scopus (798) Google Scholar, 24Lee K. Frank S. Vanderklish P. Arai A. Lynch G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1991; 88: 7233-7237Crossref PubMed Scopus (333) Google Scholar, 25Rami A. Krieglstein J. Brain Res. 1993; 609: 67-70Crossref PubMed Scopus (164) Google Scholar, 26Bartus R. Hayward N. Elliott P. Sawyer S. Baker K. Dean R. Akiyama A. Straub J. Harbeson S. Li Z. Powers J. Stroke. 1994; 25: 2265-2270Crossref PubMed Scopus (198) Google Scholar). A growing body of literature has emerged, demonstrating functional connections between calpains and caspases (27Wang K.K. Trends Neurosci. 2000; 23: 20-26Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (811) Google Scholar). Common substrate proteins have been identified, such as fodrin (28Nath R. Raser K. Stafford D. Hajimohammadreza I. Posner A. Allen H. Talanian R. Yuen P. Gilbertsen R. Wang K. Biochem. J. 1996; 319: 683-690Crossref PubMed Scopus (398) Google Scholar, 29Jänicke R. Ng P. Sprengart M. Porter A. J. Biol. Chem. 1998; 273: 15540-15545Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (444) Google Scholar, 30Vanags D. Pörn-Ares M. Coppola S. Burgess D. Orrenius S. J. Biol. Chem. 1996; 271: 31075-31085Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (356) Google Scholar, 31Wang K. Posmantur R. Nath R. McGinnis K. Whitton M. Talanian R. Galntz S. Morrow J. J. Biol. Chem. 1998; 273: 22490-22497Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (283) Google Scholar), calpastatin (32Pörn-Ares M.I. Samali A. Orrenius S. Cell Death Differ. 1998; 5: 1028-1033Crossref PubMed Scopus (184) Google Scholar, 33Wang K.K. Posmantur R. Nadimpalli R. Nath R. Mohan P. Nixon R.A. Talanian R.V. Keegan M. Herzog L. Allen H. Arch. Biochem. Biophys. 1998; 356: 187-196Crossref PubMed Scopus (231) Google Scholar), actin (34Villa P.G. Henzel W.J. Sensenbrenner M. Henderson C.E. Pettmann B. J. Cell Sci. 1998; 111: 713-722PubMed Google Scholar), PARP (35McGinnis K.M. Gnegy M.E. Park Y.H. Mukerjee N. Wang K.K. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999; 263: 94-99Crossref PubMed Scopus (165) Google Scholar), and tau (36Canu N. Dus L. Barbato C. Ciotti M.T. Brancolini C. Rinaldi A.M. Novak M. Cattaneo A. Bradbury A. Calissano P. J. Neurosci. 1998; 18: 7061-7074Crossref PubMed Google Scholar). There are reports demonstrating calpain-mediated cleavage of caspase-3 (35McGinnis K.M. Gnegy M.E. Park Y.H. Mukerjee N. Wang K.K. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999; 263: 94-99Crossref PubMed Scopus (165) Google Scholar, 37Wolf B.B. Goldstein J.C. Stennicke H.R. Beere H. Amarante-Mendes G.P. Salvesen G.S. Green D.R. Blood. 1999; 94: 1683-1692Crossref PubMed Google Scholar) and caspase-7 (38Ruiz-Vela A. Gonzalez de Buitrago G. Martinez A.C. EMBO J. 1999; 18: 4988-4998Crossref PubMed Scopus (157) Google Scholar, 39Chua B.T. Guo K. Li P. J. Biol. Chem. 2000; 275: 5131-5135Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (268) Google Scholar) as well as caspase-8 and -9 (39Chua B.T. Guo K. Li P. J. Biol. Chem. 2000; 275: 5131-5135Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (268) Google Scholar). Furthermore, the proapoptotic protein Bax was cleaved by calpain during drug-induced apoptosis of HL-60 cells (40Wood D.E. Thomas A. Devi L.A. Berman Y. Beavis R.C. Reed J.C. Newcomb E.W. Oncogene. 1998; 17: 1069-1078Crossref PubMed Scopus (306) Google Scholar), and calpain may be responsible for cleaving the loop region in Bcl-xL, thereby turning an antiapoptotic molecule into a proapoptotic one (41Nakagawa T. Yuan J. J. Cell Biol. 2000; 150: 887-894Crossref PubMed Scopus (1040) Google Scholar). One study demonstrated synergy between calpains and the proteasome downstream of caspases in constitutive apoptosis of human neutrophils (42Knepper-Nicolai B. Savill J. Brown S.B. J. Biol. Chem. 1998; 273: 30530-30536Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (108) Google Scholar), whereas other studies demonstrated an upstream regulatory role for calpains in the apoptosis of neutrophils (43Squier M.K. Sehnert A.J. Sellins K.S. Malkinson A.M. Takano E. Cohen J.J. J. Cell. Physiol. 1999; 178: 311-319Crossref PubMed Scopus (116) Google Scholar) and thymocytes (44Squier M. Cohen J. J. Immunol. 1997; 158: 3690-3697PubMed Google Scholar). Recently, Nakagawa and Yuan showed that m-calpain may be responsible for the activation of caspase-12 by the endoplasmic reticulum, indicating a link between calcium dysregulation and apoptosis (41Nakagawa T. Yuan J. J. Cell Biol. 2000; 150: 887-894Crossref PubMed Scopus (1040) Google Scholar). Previously, we found that the supposedly calpain-dependent degradation of calpastatin in a model of neonatal cerebral HI followed a biphasic pattern (45Blomgren K. Hallin U. Andersson A.L. Puka-Sundvall M. Bahr B.A. McRae A. Saido T.C. Kawashima S. Hagberg H. J. Biol. Chem. 1999; 274: 14046-14052Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (101) Google Scholar), where the second phase closely followed the activation of caspase-3. Reports demonstrating degradation of calpastatin by caspase-3 (32Pörn-Ares M.I. Samali A. Orrenius S. Cell Death Differ. 1998; 5: 1028-1033Crossref PubMed Scopus (184) Google Scholar, 33Wang K.K. Posmantur R. Nadimpalli R. Nath R. Mohan P. Nixon R.A. Talanian R.V. Keegan M. Herzog L. Allen H. Arch. Biochem. Biophys. 1998; 356: 187-196Crossref PubMed Scopus (231) Google Scholar) prompted us to investigate further the spatial and temporal activation of these two proteases and possible interactions in this model. Unilateral HI was induced in 7-day-old Wistar F rats of both sexes (46Rice J. Vannucci R. Brierley J. Ann. Neurol. 1981; 9: 131-141Crossref PubMed Scopus (1935) Google Scholar, 47Hagberg H. Gilland E. Diemer N. Andine P. Biol. Neonate. 1994; 66: 205-213Crossref PubMed Scopus (148) Google Scholar). The pups were anesthetized with halothane (3.0β for induction and 1.0–1.5β for maintenance) in a mixture of nitrous oxide and oxygen (1:1), and the duration of anesthesia was <10 min. The left common carotid artery was cut between double ligatures of prolene sutures (6–0). After the surgical procedure, the wounds were infiltrated with a local anesthetic, and the pups were allowed to recover for 1–2 h. The litters were then placed in a chamber perfused with a humidified gas mixture (7.70 ± 0.01β oxygen in nitrogen) for 70 min. The temperature in the gas chamber was kept at 36 °C. Following hypoxic exposure, the pups were returned to their biological dams until sacrificed. Control animals were operated and ligated but not subjected to hypoxia. All animal experimentation was approved by the Ethical Committee of Göteborg (approval number 225-97). Three litters (n= 28) were treated with the calpain inhibitor CX295 (Z-Leu-aminobutyric acid-CONH(CH2)3-morpholine; Cortex Pharmaceuticals, Irvine, CA) or vehicle. The first dose, 200 μl of 5 mm CX295 in 100 mm NaCl (equivalent to ∼80 μmol/kg or 40 mg/kg body weight), was administered subcutaneously immediately after HI. Subsequently, animals were injected with 100 μl of the CX295 solution (equivalent to ∼40 μmol/kg or 20 mg/kg body weight) every 3 h for 24 h. Control animals were injected with 100 mm NaCl. The animals were sacrificed by decapitation, and the brains were rapidly dissected out on a bed of ice, weighed, quickly frozen in isopenthane and dry ice, and stored at −80 °C. Cortical tissue rostral to the hippocampus, ∼50 mg, was dissected out from each hemisphere at −10 °C. The tissue was homogenized by sonication in 10 volumes of ice-cold 50 mmTris-HCl (pH 7.3), containing 5 mm EDTA, aliquoted, and stored at −80 °C. Homogenate samples were mixed with an equal volume of concentrated (3×) SDS-polyacrylamide gel electrophoresis buffer and heated (96 °C) for 5 min. Recombinant, active human caspase-3 (MBL, Nagoya, Japan), 2.0 μl of reconstituted solution (the absolute amount of caspase-3 is not known), was preincubated with 50 μl of protease inhibitor solution (see below) for 10 min and then mixed with 100 μl of 50 μmDEVD-7-amino-4-methylcoumarin (DEVD-AMC) substrate (Bachem, Bubendorf, Switzerland) in 50 mm Tris-HCl (pH 7.3) containing 100 mm NaCl, 10 mm DTT, 5 mm EDTA, 1 mm EGTA, 0.2β CHAPS, and 3 mmNaN3. Cleavage of DEVD-AMC was measured at 37 °C using a Spectramax Gemini microplate fluorometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) with an excitation wavelength of 380 nm and an emission wavelength of 440 nm. DEVD-AMC cleavage was calculated from theVmax and expressed as relative fluorescence units (RFU)/s/ml. Rabbit lung μ- or m-calpain (48Karlsson J.O. Gustavsson S. Hall C. Nilsson E. Biochem. J. 1985; 231: 201-204Crossref PubMed Scopus (45) Google Scholar) (480 pmol of AMC produced/min/ml from LY-AMC at 37 °C, the same for both isozymes) in 50 μl of buffer was preincubated with 50 μl of inhibitor solution (see below) for 10 min and then mixed with 100 μl of 1 mm LY-AMC in 20 mm Tris-HCl (pH 7.5) containing 4 mm CaCl2, 4 mmDTT, 3β Me2SO, and 3 mmNaN3. Substrate cleavage was evaluated as described for the caspase-3 assay. Inhibitors were as follows: CX295 from Cortex Pharmaceuticals (Irvine, CA) and benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethyl ketone (ZVAD) andt-butoxycarbonyl-Asp-(OMe)-fluoromethyl ketone (BAF) from Enzyme Systems Products (Livermore, CA). Samples of homogenate (50 μl) were mixed with 50 μl of extraction buffer, containing 50 mm Tris-HCl (pH 7.3), 100 mm NaCl, 5 mm EDTA, 1 mm EGTA, 3 mmNaN3, 1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 μg/ml pepstatin, 2.5 μg/ml leupeptin, 10 μg/ml aprotinin, and 0.2β CHAPS, on a microtiter plate (Microfluor; Dynex Technologies, Chantilly, VA). After incubation for 15 min at room temperature, 100 μl of peptide substrate, 50 μm Ac-DEVD-AMC (Enzyme Systems Products, Livermore, CA) in extraction buffer without inhibitors or CHAPS, but with 4 mm DTT, was added. Cleavage of DEVD-AMC was measured as described above and expressed as pmol of AMC formed per mg of protein and minute. The caspase-3 antibodies were polyclonal and raised either against the full-length precursor of human caspase-3 (H-277; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) or against the p17 fragment (residues 176–277) (number 280, a kind gift from Dr. Donald W. Nicholson, Merck Frosst Center for Therapeutic Research, Quebec, Canada). The latter antibody specifically recognized the active form of caspase-3 in tissue sections (6Zhu C. Wang X. Hagberg H. Blomgren K. J. Neurochem. 2000; 75: 819-829Crossref PubMed Scopus (111) Google Scholar). A polyclonal antibody that specifically recognizes the amino-terminal proteolytic 145-kDa breakdown product of rat α-fodrin (FBDPN) was used to detect calpain-induced fodrin cleavage (49Bahr B. Tiriveedhi S. Park G. Lynch G. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1995; 273: 902-908PubMed Google Scholar). The antibody against DFF-45/ICAD was polyclonal and was generated by immunizing rabbits with a recombinant DFF-45 fusion protein (50Liu X. Zou H. Slaughter C. Wang X. Cell. 1997; 89: 175-184Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1649) Google Scholar) (a kind gift from Dr. Xiaodong Wang, University of Texas Southwestern Medical Center). The antibodies against tubulin (clone TU-01; Sanbio, Uden, The Netherlands), PARP (clone C-2–101, Zymed Laboratories Inc., San Francisco, CA), fodrin (FG 6090, Affiniti Research Products, Mamhead, UK), and MAP 2 (clone HM-2, SIGMA) were monoclonal. All secondary antibodies and avidins (horseradish peroxidase-, biotin-, Texas Red-, or fluorescein isothiocyanate-conjugated) were from Vector Laboratories (Burlingame, CA). The specificity of the FBDP antibody for calpain-cleaved fodrin was verified by incubating a fodrin-enriched (P2) fraction with either caspase-3 or m-calpain at 37 °C. The incubations were interrupted at various time points, and the samples were subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblotting. In the fraction incubated with m-calpain, a single, prominent 145-kDa band appeared, increasing with time. In the fraction incubated with caspase-3, no bands could be detected using the FBDP antibody, although extensive degradation of fodrin was taking place, as verified using the FG 6090 antibody that recognizes the intact fodrin as well as several cleavage products (not shown). The protein concentration of homogenates in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis buffer was determined according to Karlsson et al. (51Karlsson J. Ostwald K. Kåbjorn C. Andersson M. Anal. Biochem. 1994; 219: 144-146Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar). Samples corresponding to 20 μg of bovine serum albumin were electrophoresed on NOVEX 8–16β Tris-glycine gels (NOVEX, San Diego, CA) and transferred to polyvinylidene difluoride (Hybond-P; Amersham Pharmacia Biotech) or nitrocellulose (0.45 μm, Schleicher & Schuell) membranes. Immunoreactive species were visualized using peroxidase-conjugated secondary antibodies; Super Signal Western, PICO, DURA, or FEMTO chemiluminescent substrates (Pierce); and Fuji RX film (Fuji Photo Film Co., Tokyo, Japan). Films were scanned, and immunoreactive bands were quantified using the software IPLab Gel 1.5f (Scanalytics Corp., Fairfax, VA). Alternatively, membranes were exposed in a LAS 1000 cooled CCD camera, and immunoreactive bands were quantified using the software Image Gauge (Fujifilm, Tokyo, Japan). Every sample was analyzed 1–4 times, and when multiple determinations were performed the average value was used as n = 1. Stripping of membranes for reprobing purposes was performed by incubation in 62.5 mm Tris-HCl (pH 6.7), 100 mmβ-mercaptoethanol, 2β SDS, at 50 °C for 30 min. All membranes were reprobed with the antibody against α-tubulin. Tubulin was used to normalize between samples (10Namura S. Zhu J. Fink K. Endres M. Srinivasan A. Tomaselli K.J. Yuan J. Moskowitz M.A. J. Neurosci. 1998; 18: 3659-3668Crossref PubMed Google Scholar). Pups were deeply anesthetized and perfusion-fixed with 5β formaldehyde in 0.1m phosphate buffer. The brains were rapidly removed and immersion-fixed at 4 °C for 24 h. After dehydration with graded ethanol concentrations and xylene, the brains were paraffin-embedded and cut into 4-μm coronal sections. Sections were deparaffinized in xylene and rehydrated in graded ethanol concentrations before staining. Immunopositive cells were counted in a MAP 2-negative area of parietal cortex 300 × 660 μm in size and expressed as positive cells/mm2. Sections were pretreated with proteinase K (Roche Molecular Biochemicals), 10 μg/ml in PBS for 10 min, at room temperature. Antigen recovery was performed by boiling the sections in 10 mm sodium citrate buffer (pH 6.0) for 10 min. Nonspecific binding was blocked for 30 min with 4β goat serum in PBS. Anti-caspase-3 p17 was applied diluted 1:500 in PBS and incubated for 60 min at room temperature, followed by biotinylated goat anti-rabbit IgG (6 μg/ml in PBS) or fluorescein isothiocyanate-labeled goat anti-rabbit IgG (6 μg/ml) for 60 min. Visualization was performed using Vectastain ABC Elite or fluorescence microscopy. Antigen recovery and blocking were performed as above. The anti-FBDP was applied diluted 1:50 in PBS containing 0.2β Triton X-100 and incubated for 60 min at room temperature, followed by biotinylated goat anti-rabbit IgG (11 μg/ml in PBS) or fluorescein isothiocyanate-labeled goat anti-rabbit IgG (6 μg/ml) for 60 min. Visualization was performed using Vectastain ABC Elite or fluorescence microscopy. Six pups for each time point were decapitated at 0 h, 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 72 h, and 14 days of recovery after hypoxia-ischemia. Control pups (n = 6) were decapitated on postnatal days 7, 8, 10, and 21. The brains were rapidly removed and frozen in liquid nitrogen. Total RNA was extracted from each hemisphere (52Chomczynski P. Sacchi N. Anal. Biochem. 1987; 162: 156-159Crossref PubMed Scopus (63187) Google Scholar), quantified spectrophotometrically at 260 nm, and stored at −80 °C. First strand cDNA synthesis was performed with the Superscript RNase H− Reverse Transcriptase kit (Life Technologies, Inc.) and random hexamer primers (Roche Molecular Biochemicals). Total RNA (2 μg), random primers (500 ng), and RNase-free water to 24 μl were incubated at 70 °C for 10 min. The mixture was chilled on ice, and 8 μl of 5× first strand buffer (250 mm Tris-HCl (pH 8.3), 375 mm KCl, 15 mm MgCl2), 4 μl of 0.1 m DTT, and 2 μl of 10 mm each of dATP, dGTP, dCTP, and dTTP (Roche Molecular Biochemicals) were added and incubated at 25 °C for 10 min followed by 2 min at 42 °C. RT enzyme (2 μl (400 units)) was added, and the reaction was allowed to proceed for 60 min at 42 °C, followed by 15 min of inactivation at 70 °C. The template cDNA thus obtained was diluted to 100 μl with water and stored at −20 °C. Each subsequent PCR (25 μl) contained 4 μl of template cDNA, a 0.2 mmconcentration each of dATP, dGTP, dCTP, and dTTP (Roche Molecular Biochemicals), a 1 μm concentration of each primer, 1 unit of Taq DNA polymerase (Sigma), and 2.5 μl of 10× PCR buffer (Sigma). Primers were as follows: caspase-3 (GenBankTM accession number U49930) 5′-408TTTGGAACGAACGGACCTGT-3′ (upstream) and 5′-798CACGGGATCTGTTTCTTTGC-3′ (downstream); GAPDH (GenBankTM accession number M17701), 5′-331ACCACCATGGAGAAGGCTGG-3′ (upstream) and 5′-839CTCAGTGTAGCCCAGGATGC-3′ (downstream). All primers were from Kebo Lab (Stockholm, Sweden). PCR cycling for caspase-3 was as follows: step 1, 94 °C for 5 min; step 2, 24 cycles of 94 °C for 20 s, 62 °C for 20 s, 72 °C for 20 s; step 3, 72 °C for 5 min. PCR cycling for GAPDH was as follows: step 1, 94 °C for 5 min; step 2, 20 cycles of 94 °C for 20 s, 60 °C for 20 s, 72 °C for 20 s; step 3, 72 °C for 5 min. The annealing temperatures and cycle numbers were chosen such that both the caspase-3 and the GAPDH PCR products would be in the linear phase of amplification and of similar intensity (data not shown). The PCR products (412 bp for caspase-3 and 528 bp for GAPDH) were separated on 1.5β agarose gels, stained with ethidium bromide, and photographed under UV light. The pictures were scanned, and the bands were quantified using the software IPLab Gel 1.5f (Scanalytics Corp., Fairfax, VA). The relative amount of caspase-3 mRNA was calculated after normalization to GAPDH, to compensate for errors introduced during the preparation of RNA, the production of cDNA, or the PCR. Forebrain hemispheres of P7 control animals (n = 7) were homogenized in 10 volumes of 50 mm Tris-HCl (pH 7.3), 5 mm EDTA and centrifuged at 200,000 × g for 45 min to obtain cytosolic (S3) fractions. Aliquots of 100 μl of S3, 3.0 μl of 100 mmdithiothreitol, 9.0 μl of 100 mm CaCl2, 1.0 μl of 0.5 m NaOH (to compensate for the drop in pH occurring when Ca2+ ions replace protons in the EDTA molecules), and 58.0 μl of homogenizing buffer were incubated for 30 min at 37 °C. Purified μ- or m-calpain, recombinant caspase-3, purified calpastatin (14 units/ml), calpastatin peptide (3 μg/ml; Sigma), CX295 (1 mm), ZVAD (0.7 mm), or BAF (0.88 mm) was included in some incubations, replacing partly the homogenizing buffer. When inhibitors were added, they were preincubated for 10 min with the enzymes at room temperature before being added to the S3 mixture. The reactions were stopped by adding 8.0 μl of 100 mm EDTA. Aliquots of 50 μl were assayed for DEVD cleavage, and portions equivalent to 90 μg of total protein were subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblotting. The protein concentrations were determined according to Whitaker and Granum (53Whitaker J.R. Granum P.E. Anal. Biochem. 1980; 109: 156-159Crossref PubMed Scopus (482) Google Scholar), adapted for microplates, using a Spectramax Plus plate reader (Molecular Devices). Crude calpastatin (100 units/ml) was purified from rabbit lung via hydrophobic interaction chromatography, as previously described (48Karlsson J.O. Gustavsson S. Hall C. Nilsson E. Biochem. J. 1985; 231: 201-204Crossref PubMed Scopus (45) Google Scholar) and further purified via trichloroacetic acid precipitation and gel filtration (54Belles B. Hescheler J. Trautwein W. Blomgren K. Karlsson J. Pflugers Arch. 1988; 412: 554-556Crossref PubMed Scopus (64) Google Scholar). Aliquots (50 μl) of m-calpain were incubated for 15 min at room temperature under conditions where the enzyme was half-maximally activated (0.36 mm Ca2+). Increasing amounts of active caspase-3 (1–60 units per incubation, where 1 unit is defined as the amount of caspase-3 that will release 1.0 pmol of AMC/min/ml in the DEVD-cleaving assay described above) were included to see if caspase-3 could increase the m-calpain activity directly. Calpain activity was measured as described above. Student's unpaired t test or analysis of variance with Scheffe's post hoc test were used. DEVD-cleaving activity was detectable in neonatal brain samples and increased severalfold in the ipsilateral compared with the contralateral hemispheres, in accordance with earlier findings (9Cheng Y. Deshmukh M. DaCosta A. Demaro J.A. Gidday J.M. Shah A. Sun Y. Jacquin M.F. Johnson E.M. Holtzman D.M. J. Clin. Invest. 1998; 101: 1992-1999Crossref PubMed Scopus (481) Google Scholar), and this increase displayed a maximum 24 h post-HI (not shown). The average ratio between the ipsi- and contralateral hemispheres was significantly decreased after calpain inhibition, from 1618β in the vehicle-treated animals to 606.1β in the CX295-treated animals (p = 0.0004) (TableI).Table IEffects of in vivo calpain inhibition on the activation of caspase-3RatioS.D.npββCaspase-3DEVD cleavageVehicle1618.0564.490.0004CX295606.1289.4832 kDaVehicle72.818.3110.005CX29596.017.41229/(29 + 32) kDaVehicle15.211.1110.031CX2956.885.4612ICAD45 + 32 kDaVehicle77.518.2110.006CX29599.914.510The caspase-3-like activity (DEVD cleavage), cleavage of the caspase-3 proform and degradation of endogenous caspase-3 substrate ICAD were assessed

Abstract Epidemiological studies show a markedly increased risk of cerebral palsy following the combined exposure of infection and birth asphyxia. However, the underlying mechanisms of this increased vulnerability remain unclear. We have examined the effects of a low dose of bacterial endotoxin on hypoxic–ischaemic injury in the immature brain of rats. Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide 0.3 mg/kg) was administered to 7‐day‐old rats 4 h prior to unilateral hypoxia–ischaemia and the neurological outcome was determined 3 days later. Rectal temperature and cerebral blood flow was measured during the study and the expression of CD14 and toll‐like receptor‐4 mRNA in the brain was examined. We found that a low dose of endotoxin dramatically sensitizes the immature brain to injury and induces cerebral infarction in response to short periods of hypoxia–ischaemia that by themselves caused no or little injury. This effect could not be explained by a reduction in cerebral blood flow or hyperthermia. In association with the sensitization of injury we found an altered expression of CD14 mRNA and toll‐like receptor‐4 mRNA in the brain. These results suggest that the innate immune system may be involved in the vulnerability of the immature brain following the combination of infection and hypoxia–ischaemia.

Unilateral hypoxia-ischemia (HI) was induced in C57/BL6 male mice on postnatal day (P) 5, 9, 21 and 60, corresponding developmentally to premature, term, juvenile and adult human brains, respectively. HI duration was adjusted to obtain a similar extent of brain injury at all ages. Apoptotic mechanisms (nuclear translocation of apoptosis-inducing factor, cytochrome c release and caspase-3 activation) were several-fold more pronounced in immature than in juvenile and adult brains. Necrosis-related calpain activation was similar at all ages. The CA1 subfield shifted from apoptosis-related neuronal death at P5 and P9 to necrosis-related calpain activation at P21 and P60. Oxidative stress (nitrotyrosine formation) was also similar at all ages. Autophagy, as judged by the autophagosome-related marker LC-3 II, was more pronounced in adult brains. To our knowledge, this is the first report demonstrating developmental regulation of AIF-mediated cell death as well as involvement of autophagy in a model of brain injury.

The purpose of this study was to evaluate the efficacy and safety of erythropoietin in neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), by using a randomized, prospective study design.A total of 167 term infants with moderate/severe HIE were assigned randomly to receive either erythropoietin (N = 83) or conventional treatment (N = 84). Recombinant human erythropoietin, at either 300 U/kg (N = 52) or 500 U/kg (N = 31), was administered every other day for 2 weeks, starting <48 hours after birth. The primary outcome was death or disability. Neurodevelopmental outcomes were assessed at 18 months of age.Complete outcome data were available for 153 infants. Nine patients dropped out during treatment, and 5 patients were lost to follow-up monitoring. Death or moderate/severe disability occurred for 35 (43.8%) of 80 infants in the control group and 18 (24.6%) of 73 infants in the erythropoietin group (P = .017) at 18 months. The primary outcomes were not different between the 2 erythropoietin doses. Subgroup analyses indicated that erythropoietin improved long-term outcomes only for infants with moderate HIE (P = .001) and not those with severe HIE (P = .227). No negative hematopoietic side effects were observed.Repeated, low-dose, recombinant human erythropoietin treatment reduced the risk of disability for infants with moderate HIE, without apparent side effects.

Cell isolation protocols from brain tissue include prolonged

ABSTRACT Microglial phagocytosis is rapidly emerging as a therapeutic target in neurodegenerative and neurological disorders. An efficient removal of cellular debris is necessary to prevent buildup damage of neighbor neurons and the development of an inflammatory response. As the brain professional phagocytes, microglia are equipped with an array of mechanisms that enable them to recognize and degrade several types of cargo, including neurons undergoing apoptotic cell death. While microglia are very competent phagocytes of apoptotic cells under physiological conditions, here we report their dysfunction in mouse and monkey ( Macaca fascicularis and Callithrix jacchus ) models of stroke by transient occlusion of the medial cerebral artery (tMCAo). The impairment of both engulfment and degradation was related to energy depletion triggered by oxygen and nutrients deprivation (OND), which led to reduced process motility, lysosomal depletion, and the induction of a protective autophagy response in microglia. Basal autophagy, which is in charge of removing and recycling intracellular elements, was critical to maintain microglial physiology, including survival and phagocytosis, as we determined both in vivo and in vitro using knock-out models of autophagy genes and the autophagy inhibitor MRT68921. Notably, the autophagy inducer rapamycin partially prevented the phagocytosis impairment induced by tMCAo in vivo but not by OND in vitro. These results suggest a more complex role of microglia in stroke than previously acknowledged, classically related to the inflammatory response. In contrast, here we demonstrate the impairment of apoptotic cell phagocytosis, a microglial function critical for brain recovery. We propose that phagocytosis is a therapeutic target yet to be explored and provide evidence that it can be modulated in vivo using rapamycin, setting the stage for future therapies for stroke patients.

Abstract Diversity within microglia, the resident brain immune cells, is reported. Whether microglial subsets constitute different subtypes with intrinsic properties and unique functions has not been fully elucidated. Here, we describe a microglial subtype characterized by the expression of the enzyme Arginase-1, i.e. Arg1 + microglia, which is found predominantly in the cholinergic neuron-rich forebrain region during early postnatal development. Arg1 + microglia are frequently observed in close apposition to neurons and exhibit a distinctive molecular signature reflecting a reactive profile. Arg1 deficiency in microglia results in impaired dendritic spine maturation in the hippocampus where cholinergic neurons project, and cognitive behavioural deficiencies in female mice. Our results expand on microglia diversity and provide insights into distinctive spatiotemporal functions exerted by microglial subtypes.

Accumulating clinical observations implicate vascular inflammation as an underlying cause of coagulopathy in severely ill COVID-19 patients and it was recently suggested that SARS-CoV-2 virus particles infect endothelial cells. Here, we show that endothelial cells do not express angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2), the SARS-CoV-2 receptor. Instead, pericytes and microvascular smooth muscle cells express ACE2 in an organotypic manner. Pericyte deficiency leads to increased endothelial expression and release of Von Willebrand factor and intravascular platelet and fibrin aggregation, suggesting that pericytes limit endothelial pro-thrombotic responses. That pericytes and not endothelial cells express ACE2 may provide important clues to the pathology of COVID-19, as pericytes are normally shielded behind an endothelial barrier and may get infected only when this barrier is compromised by COVID-19 risk factors.

Abstract Alzheimer’s disease is a progressive neurological disorder causing memory loss and cognitive decline. The underlying causes of cognitive deterioration and neurodegeneration remain unclear, leading to a lack of effective strategies to prevent dementia. Recent evidence highlights the role of neuroinflammation, particularly involving microglia, in Alzheimer’s disease onset and progression. Characterizing the initial phase of Alzheimer’s disease can lead to the discovery of new biomarkers and therapeutic targets, facilitating timely interventions for effective treatments. We used the App NL-G-F knock-in mouse model, which resembles the amyloid pathology and neuroinflammatory characteristics of Alzheimer’s disease, to investigate the transition from a pre-plaque to an early plaque stage with a combined functional and molecular approach. Our experiments show a progressive decrease in the power of cognition-relevant hippocampal gamma oscillations during the early stage of amyloid pathology, together with a modification of fast-spiking interneuron intrinsic properties and postsynaptic input. Consistently, transcriptomic analyses revealed that these effects are accompanied by changes in synaptic function-associated pathways. Concurrently, homeostasis-and inflammatory-related microglia signature genes were downregulated. Moreover, we found a decrease in Iba1-positive microglia in the hippocampus that correlates with plaque aggregation and neuronal dysfunction. Collectively, these findings support the hypothesis that microglia play a protective role during the early stages of amyloid pathology by preventing plaque aggregation, supporting neuronal homeostasis, and overall preserving the oscillatory network’s functionality. These results suggest that the early loss of microglia could be a pivotal event in the progression of Alzheimer’s disease, potentially triggering plaque deposition, impairment of fast-spiking interneurons, and the breakdown of the oscillatory circuitry in the hippocampus.