Abstract The idea that information can be transmitted to subsequent generation(s) by epigenetic means has been studied for decades but remains controversial in humans. Epidemiological studies have established that grandparental exposures are associated with health outcomes in their grandchildren, often with sex-specific effects; however the mechanism of transmission is still unclear. We conducted Epigenome Wide Association Studies (EWAS) to test whether grandmaternal smoking during pregnancy is associated with altered DNA methylation (DNAm) in their adolescent grandchildren. We used data from a birth cohort, with discovery and replication datasets of 1225 and 708 individuals (respectively), aged 15-17 years, and tested replication in the same individuals at birth and 7 years. We show for the first time that DNAm at a small number of loci is associated with grandmaternal smoking in humans, and their locations in the genome suggest hypotheses of transmission. We observe and replicate sex-specific associations at two sites on the X chromosome, one located in an imprinting control region and both within transcription factor binding sites (TFBSs). In fact, we observe enrichment for TFBSs among the CpG sites with the strongest associations, suggesting that TFBSs may be a mechanism by which grandmaternal exposures influence offspring DNA methylation. There is limited evidence that these associations appear at earlier timepoints, so effects are not static throughout development. The implication of this work is that effects of smoking during pregnancy may induce DNAm changes in later generations and that these changes are often sex-specific, in line with observational associations.

Importance Epigenetic age acceleration is associated with exposure to social and economic adversity and may increase the risk of premature morbidity and mortality. However, no studies have included measures of structural racism, and few have compared estimates within or across the first and second generation of epigenetic clocks. Objective To determine whether epigenetic age acceleration is positively associated with exposures to diverse measures of racialized, economic, and environmental injustice measured at different levels and time periods. Design, Setting, and Participants This cross-sectional study used data from the My Body My Story (MBMS) study between August 8, 2008, and December 31, 2010, and examination 5 of the Multi-Ethnic Atherosclerosis Study (MESA) from April 1, 2010, to February 29, 2012. In the MBMS, DNA extraction was performed in 2021; linkage of structural measures to the MBMS and MESA, in 2022. US-born individuals were randomly selected from 4 community health centers in Boston, Massachusetts (MBMS), and 4 field sites in Baltimore, Maryland; Forsyth County, North Carolina; New York City, New York; and St Paul, Minnesota (MESA). Data were analyzed from November 13, 2021, to August 31, 2023. Main Outcomes and Measures Ten epigenetic clocks (6 first-generation and 4 second-generation), computed using DNA methylation data (DNAm) from blood spots (MBMS) and purified monocytes (MESA). Results The US-born study population included 293 MBMS participants (109 men [37.2%], 184 women [62.8%]; mean [SD] age, 49.0 [8.0] years) with 224 Black non-Hispanic and 69 White non-Hispanic participants and 975 MESA participants (492 men [50.5%], 483 women [49.5%]; mean [SD] age, 70.0 [9.3] years) with 229 Black non-Hispanic, 191 Hispanic, and 555 White non-Hispanic participants. Of these, 140 (11.0%) exhibited accelerated aging for all 5 clocks whose estimates are interpretable on the age (years) scale. Among Black non-Hispanic MBMS participants, epigenetic age acceleration was associated with being born in a Jim Crow state by 0.14 (95% CI, 0.003-0.27) SDs and with birth state conservatism by 0.06 (95% CI, 0.01-0.12) SDs, pooling across all clocks. Low parental educational level was associated with epigenetic age acceleration, pooling across all clocks, for both Black non-Hispanic (0.24 [95% CI, 0.08-0.39] SDs) and White non-Hispanic (0.27 [95% CI, 0.03-0.51] SDs) MBMS participants. Adult impoverishment was positively associated with the pooled second-generation clocks among the MESA participants (Black non-Hispanic, 0.06 [95% CI, 0.01-0.12] SDs; Hispanic, 0.07 [95% CI, 0.01-0.14] SDs; White non-Hispanic, 0.05 [95% CI, 0.01-0.08] SDs). Conclusions and Relevance The findings of this cross-sectional study of MBMS and MESA participants suggest that epigenetic age acceleration was associated with racialized and economic injustice, potentially contributing to well-documented inequities in premature mortality. Future research should test the hypothesis that epigenetic accelerated aging may be one of the biological mechanisms underlying the well-documented elevated risk of premature morbidity and mortality among social groups subjected to racialized and economic injustice.

Abstract DNA methylation (DNAm) is known to play a pivotal role in childhood health and development, but a comprehensive characterization of genome-wide DNAm trajectories across this age period is currently lacking. We have therefore performed a series of epigenome-wide association studies in 5,019 blood samples collected at multiple time-points from birth to late adolescence from 2,348 participants of two large independent cohorts. DNAm profiles of autosomal CpG sites (CpGs) were generated using the Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Change over time was widespread, observed at over one-half (53%) of CpGs. In most cases DNAm was decreasing (36% of CpGs). Inter-individual variation in linear trajectories was similarly widespread (27% of CpGs). Evidence for nonlinear change and inter-individual variation in nonlinear trajectories was somewhat less common (11% and 8% of CpGs, respectively). Very little inter-individual variation in change was explained by sex differences (0.4% of CpGs) even though sex-specific DNAm was observed at 5% of CpGs. DNAm trajectories were distributed non-randomly across the genome. For example, CpGs with decreasing DNAm were enriched in gene bodies and enhancers and were annotated to genes enriched in immune-developmental functions. By contrast, CpGs with increasing DNAm were enriched in promoter regions and annotated to genes enriched in neurodevelopmental functions. These findings depict a methylome undergoing widespread and often nonlinear change throughout childhood. They support a developmental role for DNA methylation that extends beyond birth into late adolescence and has implications for understanding life-long health and disease. DNAm trajectories can be visualized at http://epidelta.mrcieu.ac.uk .

Abstract DNA methylation (DNAm) at specific sites can be used to calculate ‘epigenetic clocks’, which in adulthood are used as indicators of age( ing ). However, little is known about how these clock sites ‘behave’ during development and what factors influence their variability in early life. This knowledge could be used to optimize healthy aging well before the onset of age-related conditions. Here, we leveraged results from two longitudinal population-based cohorts ( N =5,019 samples from 2,348 individuals) to characterize trajectories of adult clock sites from birth to early adulthood. We find that clock sites (i) diverge widely in their developmental trajectories, often showing non-linear change over time; (ii) are substantially more likely than non-clock sites to vary between individuals already from birth, differences that are predictive of DNAm variation at later ages; and (iii) show enrichment for genetic and prenatal environmental exposures, supporting an early-origins perspective to epigenetic aging.

Prenatal cigarette smoke is an environmental stressor that has a profound effect on DNA methylation in the exposed offspring. We have previously shown that some of these effects persist throughout childhood and into adolescence. Of interest is whether these signals persist into adulthood. We conducted an analysis to investigate associations between reported maternal smoking in pregnancy and DNA methylation in peripheral blood of women in the Avon Longitudinal Study of Parents and Children (ALSPAC) (n=754; mean age 30 years). We observed associations at 15 CpG sites in 11 gene regions, MYO1G, FRMD4A, CYP1A1, CNTNAP2, ARL4C, AHRR, TIFAB, MDM4, AX748264, DRD1, FTO (FDR < 5%). All but two of these CpG sites have previously been identified in relation to prenatal smoke exposure in the offspring at birth and the majority showed persistent hypermethylation among the offspring of smokers. We confirmed that most of these associations were not driven by own smoking and that they were still present 18 years later (N = 656; mean age 48 years). In addition, we replicated findings of a persistent methylation signal related to prenatal smoke exposure in peripheral blood among men in the ALSPAC cohort (N = 230; mean age 53 years). For both participant groups, there was a strong signal of association above that expected by chance at CpG sites previously associated with prenatal smoke exposure in newborns (Wilcoxon rank sum p-value < 2.2 x 10-4). Furthermore, we found that a prenatal smoking score, derived by combining methylation values at these CpG sites, could predict whether the mothers of the ALSPAC women smoked during pregnancy with an AUC 0.69 (95% 0.67, 0.73).

Background. Technological advances in high throughput DNA methylation microarrays have allowed dramatic growth of a new branch of epigenetic epidemiology. DNA methylation datasets are growing ever larger in terms of the number of samples profiled, the extent of genome coverage, and the number of studies being meta-analysed. Novel computational solutions are required to efficiently handle these data. Methods. We have developed meffil, an R package designed to quality control, normalize and perform epigenome-wide association studies (EWAS) efficiently on large samples of Illumina Infinium HumanMethylation450 and MethylationEPIC BeadChip microarrays. We tested meffil by applying it to 6000 450k microarrays generated from blood collected for two different datasets. Results. A complete reimplementation of functional normalization minimizes computational memory requirements to 5% of that required by other R packages, without increasing running time. Incorporating fixed and random fixed effects alongside functional normalization, and automated estimation of functional normalisation parameters reduces technical variation in DNA methylation levels, thus reducing false positive associations and improving power. We also demonstrate that the ability to normalize datasets distributed across physically different locations without sharing any biologically-based individual-level data may reduce heterogeneity in meta-analyses of epigenome-wide association studies. However, when batch is perfectly confounded with cases and controls functional normalization is unable to prevent spurious associations. Conclusions. meffil is available online (https://github.com/perishky/meffil/) along with tutorials covering typical use cases.

Abstract Rationale Experimental studies suggest that exposures may impact respiratory health across generations via epigenetic changes transmitted specifically through male germ cells. Studies in humans are however limited. We aim to identify epigenetic marks in offspring associated with father’s preconception smoking. Methods We conducted epigenome-wide association studies (EWAS) in the RHINESSA cohort on father’s any preconception smoking (N=875 offspring) and father’s pubertal onset smoking <15 years (N=304), using Infinium MethylationEPIC Beadchip arrays, adjusting for offspring age, maternal smoking and personal smoking. EWAS of maternal and offspring personal smoking were performed for replication. Results Father’s smoking commencing preconception was associated with methylation of blood DNA in offspring at two Cytosine-phosphate-Guanine sites (CpGs) (False Discovery Rate (FDR) <0.05) in PRR5 and CENPP . Father’s pubertal onset smoking was associated with 19 CpGs (FDR <0.05) mapped to 14 genes ( TLR9, DNTT, FAM53B, NCAPG2, PSTPIP2, MBIP, C2orf39, NTRK2, DNAJC14, CDO1, PRAP1, TPCN1, IRS1 and CSF1R ). These differentially methylated sites were hypermethylated and associated with promoter regions capable of gene silencing. Some of these sites were associated with offspring outcomes in this cohort including ever-asthma (NTRK2), ever-wheezing (DNAJC14, TPCN1), weight (FAM53B, NTRK2) and BMI (FAM53B, NTRK2) (P< 0.05). Pathway analysis showed enrichment for gene ontology pathways including regulation of gene expression, inflammation and innate immune responses. Conclusion Father’s preconception smoking, particularly in puberty, is associated with offspring DNA methylation, providing evidence that epigenetic mechanisms may underly epidemiological observations that pubertal paternal smoking increases risk of offspring asthma, low lung function and obesity.

Importance: DNA methylation (DNAm) provides a plausible mechanism by which adverse exposures become embodied and contribute to health inequities, due to its role in genome regulation and responsiveness to social and biophysical exposures tied to societal context. However, scant epigenome-wide association studies (EWAS) have included structural and lifecourse measures of exposure, especially in relation to structural discrimination. Objective: Our study tests the hypothesis that DNAm is a mechanism by which racial discrimination, economic adversity, and air pollution become biologically embodied. Design: A series of cross-sectional EWAS, conducted in My Body My Story (MBMS, biological specimens collected 2008-2010, DNAm assayed in 2021); and the Multi Ethnic Study of Atherosclerosis (MESA; biological specimens collected 2010-2012, DNAm assayed in 2012-2013); using new georeferenced social exposure data for both studies (generated in 2022). Setting: MBMS was recruited from four community health centers in Boston; MESA was recruited from four field sites in: Baltimore, MD; Forsyth County, NC; New York City, NY; and St. Paul, MN. Participants: Two population-based samples of US-born Black non-Hispanic (Black NH), white non-Hispanic (white NH), and Hispanic individuals (MBMS; n=224 Black NH and 69 white NH) and (MESA; n=229 Black NH, n=555 white NH and n=191 Hispanic). Exposures: Eight social exposures encompassing racial discrimination, economic adversity, and air pollution. Main outcome: Genome-wide changes in DNAm, as measured using the Illumina EPIC BeadChip (MBMS; using frozen blood spots) and Illumina 450k BeadChip (MESA; using purified monocytes). Our hypothesis was formulated after data collection. Results: We observed the strongest associations with traffic-related air pollution (measured via black carbon and nitrogen oxides exposure), with evidence from both studies suggesting that air pollution exposure may induce epigenetic changes related to inflammatory processes. We also found suggestive associations of DNAm variation with measures of structural racial discrimination (e.g., for Black NH participants, born in a Jim Crow state; adult exposure to racialized economic residential segregation) situated in genes with plausible links to effects on health. Conclusions and Relevance: Overall, this work suggests that DNAm is a biological mechanism through which structural racism and air pollution become embodied and may lead to health inequities.

A differentially methylated region (DMR) is a genomic region in which DNA methylation is consistently positively or negatively associated with a phenotype or exposure. We demonstrate that existing algorithms for identifying DMRs either fail to consistently control false positive rates (comb-p and DMRcate), suffer from low power (bumphunter) or lack modeling flexibility (seqlm). We introduce a new method, dmrff, that overcomes these shortcomings and can additionally be used to meta-analyze multiple datasets. When applied to investigate associations of age in multiple datasets, dmrff identifies novel DMRs near genes previously linked to age. An R implementation is available on Github (http://github.com/perishky/dmrff).

Pre-pregnancy maternal obesity is associated with adverse offspring outcomes at birth and later in life. Individual studies have shown that epigenetic modifications such as DNA methylation could contribute. Within the Pregnancy and Childhood Epigenetics (PACE) Consortium, we meta-analysed the association between pre-pregnancy maternal BMI and methylation at over 450,000 sites in newborn blood DNA, across 19 cohorts (9,340 mother-newborn pairs). We attempted to infer causality by comparing effects of maternal versus paternal BMI and incorporating genetic variation. In four additional cohorts (1,817 mother-child pairs), we meta-analysed the association between maternal BMI at the start of pregnancy and blood methylation in adolescents. In newborns, maternal BMI was associated with small (<0.2% per BMI unit (1kg/m2), P<1.06*10-7) methylation variation at 9,044 sites throughout the genome. Adjustment for estimated cell proportions greatly attenuated the number of significant CpGs to 104, including 86 sites common to the unadjusted model. At 72/86 sites, the direction of association was the same in newborns and adolescents, suggesting persistence of signals. However, we found evidence for a causal intrauterine effect of maternal BMI on newborn methylation at just 8/86 sites. In conclusion, this well-powered analysis identified robust associations between maternal adiposity and variations in newborn blood DNA methylation, but these small effects may be better explained by genetic or lifestyle factors than a causal intrauterine mechanism. This highlights the need for large-scale collaborative approaches and the application of causal inference techniques in epigenetic epidemiology.