Spatially resolved transcriptomic technologies are promising tools to study complex biological processes such as mammalian embryogenesis. However, the imbalance between resolution, gene capture, and field of view of current methodologies precludes their systematic application to analyze relatively large and three-dimensional mid- and late-gestation embryos. Here, we combined DNA nanoball (DNB)-patterned arrays and in situ RNA capture to create spatial enhanced resolution omics-sequencing (Stereo-seq). We applied Stereo-seq to generate the mouse organogenesis spatiotemporal transcriptomic atlas (MOSTA), which maps with single-cell resolution and high sensitivity the kinetics and directionality of transcriptional variation during mouse organogenesis. We used this information to gain insight into the molecular basis of spatial cell heterogeneity and cell fate specification in developing tissues such as the dorsal midbrain. Our panoramic atlas will facilitate in-depth investigation of longstanding questions concerning normal and abnormal mammalian development.

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic poses a current world-wide public health threat. However, little is known about its hallmarks compared to other infectious diseases. Here, we report the single-cell transcriptional landscape of longitudinally collected peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in both COVID-19- and influenza A virus (IAV)-infected patients. We observed increase of plasma cells in both COVID-19 and IAV patients and XIAP associated factor 1 (XAF1)-, tumor necrosis factor (TNF)-, and FAS-induced T cell apoptosis in COVID-19 patients. Further analyses revealed distinct signaling pathways activated in COVID-19 (STAT1 and IRF3) versus IAV (STAT3 and NFκB) patients and substantial differences in the expression of key factors. These factors include relatively increase of interleukin (IL)6R and IL6ST expression in COVID-19 patients but similarly increased IL-6 concentrations compared to IAV patients, supporting the clinical observations of increased proinflammatory cytokines in COVID-19 patients. Thus, we provide the landscape of PBMCs and unveil distinct immune response pathways in COVID-19 and IAV patients.

MicroRNAs (miRNAs) are emerging critical regulators of cell function that frequently reside in clusters throughout the genome. They influence a myriad of cell functions, including the generation of induced pluripotent stem cells, also termed reprogramming. Here, we have successfully delivered entire miRNA clusters into reprogramming fibroblasts using retroviral vectors. This strategy avoids caveats associated with transient transfection of chemically synthesized miRNA mimics. Overexpression of 2 miRNA clusters, 106a–363 and in particular 302–367, allowed potent increases in induced pluripotent stem cell generation efficiency in mouse fibroblasts using 3 exogenous factors (Sox2, Klf4, and Oct4). Pathway analysis highlighted potential relevant effectors, including mesenchymal-to-epithelial transition, cell cycle, and epigenetic regulators. Further study showed that miRNA cluster 302–367 targeted TGFβ receptor 2, promoted increased E-cadherin expression, and accelerated mesenchymal-to-epithelial changes necessary for colony formation. Our work thus provides an interesting alternative for improving reprogramming using miRNAs and adds new evidence for the emerging relationship between pluripotency and the epithelial phenotype. MicroRNAs (miRNAs) are emerging critical regulators of cell function that frequently reside in clusters throughout the genome. They influence a myriad of cell functions, including the generation of induced pluripotent stem cells, also termed reprogramming. Here, we have successfully delivered entire miRNA clusters into reprogramming fibroblasts using retroviral vectors. This strategy avoids caveats associated with transient transfection of chemically synthesized miRNA mimics. Overexpression of 2 miRNA clusters, 106a–363 and in particular 302–367, allowed potent increases in induced pluripotent stem cell generation efficiency in mouse fibroblasts using 3 exogenous factors (Sox2, Klf4, and Oct4). Pathway analysis highlighted potential relevant effectors, including mesenchymal-to-epithelial transition, cell cycle, and epigenetic regulators. Further study showed that miRNA cluster 302–367 targeted TGFβ receptor 2, promoted increased E-cadherin expression, and accelerated mesenchymal-to-epithelial changes necessary for colony formation. Our work thus provides an interesting alternative for improving reprogramming using miRNAs and adds new evidence for the emerging relationship between pluripotency and the epithelial phenotype. IntroductionPluripotent and differentiated cell fates are determined at least in part by tissue-specific transcription factors that impose a concrete genetic program (1Takahashi K. Yamanaka S. Cell. 2006; 126: 663-676Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (18471) Google Scholar). In addition to coding RNAs, noncoding RNAs (2Bartel D.P. Cell. 2009; 136: 215-233Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (15577) Google Scholar) are an integral part of the genetic programs that specify cell fate, regulating, for example, the expression of key cell-specific transcription factors (3Tay Y. Zhang J. Thomson A.M. Lim B. Rigoutsos I. Nature. 2008; 455: 1124-1128Crossref PubMed Scopus (1129) Google Scholar) and chromatin stability (4van Wolfswinkel J.C. Ketting R.F. J. Cell Sci. 2010; 123: 1825-1839Crossref PubMed Scopus (83) Google Scholar) and therefore cell-specific properties. miRNAs 4The abbreviations used are: miRNA, microRNA; ESC, embryonic stem cell; iPSC, induced pluripotent stem cell; MEF, mouse embryonic fibroblast; TGFβR, TGFβ receptor; qRT, quantitative RT; EMT, epithelial-to-mesenchymal transition; MET, mesenchymal-to-epithelial transition. are 21–23-nucleotide-long noncoding RNAs that, by inducing degradation and/or preventing translation of target mRNAs (2Bartel D.P. Cell. 2009; 136: 215-233Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (15577) Google Scholar), modulate a plethora of cell functions, including those related to ESC self-renewal/differentiation (5Xu N. Papagiannakopoulos T. Pan G. Thomson J.A. Kosik K.S. Cell. 2009; 137: 647-658Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (940) Google Scholar) and cell cycle progression (6Wang Y. Baskerville S. Shenoy A. Babiarz J.E. Baehner L. Blelloch R. Nat. Genet. 2008; 40: 1478-1483Crossref PubMed Scopus (542) Google Scholar). In this context, it is not only expected that miRNAs can enhance reprogramming but also tempting to speculate that, in the right combination, they might be able to reset somatic cells into iPSCs without added factors. Blelloch and co-workers (7Judson R.L. Babiarz J.E. Venere M. Blelloch R. Nat. Biotechnol. 2009; 27: 459-461Crossref PubMed Scopus (588) Google Scholar) observed that, in the original mixture devised by Takahashi and Yamanaka (1Takahashi K. Yamanaka S. Cell. 2006; 126: 663-676Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (18471) Google Scholar), c-Myc can be substituted by components of the miR-290 cluster or by miR-302d. Elimination of c-Myc is desirable because it reduces tumor formation but has a negative effect on reprogramming. However, use of chemically synthesized oligonucleotides involves repeated transfection, and this implies a transient effect, toxicity, and an inability to pool large numbers of miRNAs without reducing their concentration beyond an optimal threshold. The latter is a concern because many ESC-specific miRNAs reside clustered within the same genome locus, and one could argue that delivering some or all these miRNA clusters together should be optimal for producing iPSCs. In this regard, we demonstrate herein that stable overexpression of entire endogenous miRNA clusters can potently improve reprogramming and be an effective tool for mechanistic analysis.RESULTS AND DISCUSSIONWe chose 3 miRNA clusters with high relative expression in ESCs compared with somatic cells based on our recent work (9Li R. Liang J. Ni S. Zhou T. Qing X. Li H. He W. Chen J. Li F. Zhuang Q. Qin B. Xu J. Li W. Yang J. Gan Y. Qin D. Feng S. Song H. Yang D. Zhang B. Zeng L. Lai L. Esteban M.A. Pei D. Cell Stem Cell. 2010; 7: 51-63Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (894) Google Scholar) and insights from other studies (10Marson A. Levine S.S. Cole M.F. Frampton G.M. Brambrink T. Johnstone S. Guenther M.G. Johnston W.K. Wernig M. Newman J. Calabrese J.M. Dennis L.M. Volkert T.L. Gupta S. Love J. Hannett N. Sharp P.A. Bartel D.P. Jaenisch R. Young R.A. Cell. 2008; 134: 521-533Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1196) Google Scholar, 11Lin S.L. Chang D.C. Chang-Lin S. Lin C.H. Wu D.T. Chen D.T. Ying S.Y. RNA. 2008; 14: 2115-2124Crossref PubMed Scopus (366) Google Scholar). miR-200b–429, miR-106a–363, and miR-302–367 are hereafter referred to as clusters A, B, and C, respectively (Fig. 1A). Cluster A contains miR-200b/a and -429, which are associated with maintenance of an epithelial phenotype (12Gregory P.A. Bert A.G. Paterson E.L. Barry S.C. Tsykin A. Farshid G. Vadas M.A. Khew-Goodall Y. Goodall G.J. Nat. Cell Biol. 2008; 10: 593-601Crossref PubMed Scopus (3117) Google Scholar). Cluster B contains miR-106a, -18b, -20b, -19b-2, -92a-2, and -363. Cluster C contains miR-302b/c/a/d and -367. miR-106a and -20b and miR-302 members, as well as constituents of the miR-294 cluster, belong to the so-called ESC cycle-regulating group of miRNAs responsible for modulating the unique characteristics of the ESC cycle (6Wang Y. Baskerville S. Shenoy A. Babiarz J.E. Baehner L. Blelloch R. Nat. Genet. 2008; 40: 1478-1483Crossref PubMed Scopus (542) Google Scholar). miR-106a/b and several miRNA components in cluster C display similarity in the seed region that helps determine target specificity (2Bartel D.P. Cell. 2009; 136: 215-233Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (15577) Google Scholar) (supplemental Fig. S1). Members of the miR-294 cluster share this similarity as well, suggesting that the 3 clusters may act in tandem to impose changes in the ESC program. First, we verified high expression of each individual endogenous miRNA of the 3 clusters in mouse ESCs compared with fibroblasts by qRT-PCR (supplemental Fig. S2A). We then amplified their genomic loci by PCR and separately cloned them into a retroviral vector commonly used to induce reprogramming (1Takahashi K. Yamanaka S. Cell. 2006; 126: 663-676Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (18471) Google Scholar, 8Esteban M.A. Wang T. Qin B. Yang J. Qin D. Cai J. Li W. Weng Z. Chen J. Ni S. Chen K. Li Y. Liu X. Xu J. Zhang S. Li F. He W. Labuda K. Song Y. Peterbauer A. Wolbank S. Redl H. Zhong M. Cai D. Zeng L. Pei D. Cell Stem Cell. 2010; 6: 71-79Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (785) Google Scholar). We envisaged that a fragment containing not only the miRNA precursor sequence but also tens of flanking bases would result in effective cleavage of the large primary miRNA product into mature miRNAs. Increased expression of each individual component was validated by qRT-PCR after delivery into fibroblasts (supplemental Fig. S3). The -fold increase in miR-106a, -20b, 19b, -92a, -367, and -429 was less remarkable possibly due to higher basal expression in fibroblasts relative to miR-302 components (supplemental Fig. S2B). Next, we overexpressed the 3 miRNA clusters together with Sox2, Klf4, and Oct4, with or without c-Myc, using donor fibroblasts that bear a transgenic oct4 reporter driving GFP expression as an indication of full reprogramming (8Esteban M.A. Wang T. Qin B. Yang J. Qin D. Cai J. Li W. Weng Z. Chen J. Ni S. Chen K. Li Y. Liu X. Xu J. Zhang S. Li F. He W. Labuda K. Song Y. Peterbauer A. Wolbank S. Redl H. Zhong M. Cai D. Zeng L. Pei D. Cell Stem Cell. 2010; 6: 71-79Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (785) Google Scholar, 9Li R. Liang J. Ni S. Zhou T. Qing X. Li H. He W. Chen J. Li F. Zhuang Q. Qin B. Xu J. Li W. Yang J. Gan Y. Qin D. Feng S. Song H. Yang D. Zhang B. Zeng L. Lai L. Esteban M.A. Pei D. Cell Stem Cell. 2010; 7: 51-63Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (894) Google Scholar). Cluster B and, more remarkably, cluster C significantly enhanced the number of GFP+ colonies counted at day 11 post-infection with 4 factors or day 15 with 3 factors (Fig. 1, B and C), whereas cluster A did not have any effect. The improvement by clusters B and C was more evident with 3 factors than with 4, and in both cases, we observed strong synergy with vitamin C, which is known to improve reprogramming (Fig. 1C) (8Esteban M.A. Wang T. Qin B. Yang J. Qin D. Cai J. Li W. Weng Z. Chen J. Ni S. Chen K. Li Y. Liu X. Xu J. Zhang S. Li F. He W. Labuda K. Song Y. Peterbauer A. Wolbank S. Redl H. Zhong M. Cai D. Zeng L. Pei D. Cell Stem Cell. 2010; 6: 71-79Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (785) Google Scholar). The increase in GFP+ colonies and the accelerated time course with 3 factors and cluster C is notable as, under normal experimental conditions, only a few colonies emerge as late as day 20. We also noticed that most (if not all) of the colonies produced with 3 factors and cluster B or C had ESC-like morphology and were GFP+ rather than representing incompletely reprogrammed cells. GFP+ colonies could be readily picked and expanded and were pluripotent using standard procedures, including the formation of chimeric mice with germ-line transmission (Fig. 1, D and E, and supplemental Fig. S4). These miRNAs had integrated into the iPSC genome, but their expression was mostly silenced, as with the exogenous transcription factors (Fig. 1, F and G). Therefore, stable overexpression of endogenous miRNA clusters can greatly improve the reprogramming of somatic cells.Next, we tried to understand the differential effect of miRNA clusters B and C on 3 versus 4 factors. We hypothesized that the 2-factor combinations may mediate differential activation of endogenous miRNA clusters B and C. qRT-PCR showed indeed that miR-106a, -19b, -20b, and -92a were significantly up-regulated by 4 factors compared with 3 and by individual overexpression of c-Myc (Fig. 2A). In contrast, miR-302b/d were induced by 4 factors but not by c-Myc alone (Fig. 2A). The latter result suggests an indirect effect of the 4 factors or a single factor-mediated effect that needs prior opening of the chromatin through the combined action of all factors. Other components of clusters B and C did not show any noticeable change (data not shown). We then analyzed the relative contribution of each miRNA by overexpressing them individually or in combination, also using retroviral vectors and adding vitamin C to magnify differences. In the context of cluster B, only miR-106a and -20b could improve the 3-factor basal efficiency (Fig. 2B). On the other hand, the combination of miR-302b/c/a/d was almost as potent as intact cluster C, whereas miR-367 alone had no effect (Fig. 2B). The choice for this division is that all miR-302 components are rather similar, and thus, one would expect redundancy. The relative contributions of endogenous miR-106a and -20b in cluster B and the miR-302 family in cluster C were demonstrated by transient transfection of specific miRNA antagonists (antagomirs) (13Krützfeldt J. Rajewsky N. Braich R. Rajeev K.G. Tuschl T. Manoharan M. Stoffel M. Nature. 2005; 438: 685-689Crossref PubMed Scopus (3325) Google Scholar) in fibroblasts transduced with 3 factors plus miRNA cluster B or C (Fig. 2C); these experiments were performed also with added vitamin C. These results show that c-Myc directly and indirectly up-regulated key miRNAs to overcome the low basal reprogramming efficiency of 3 factors compared with 4.FIGURE 2Effect of c-Myc endogenous miRNA clusters B and C and identification of key miRNA components. A, MEFs were infected with empty vector retroviruses (control), individual factors, and 3 or 4 factors. The control empty vector for the 3- or 4-factor infections was adjusted to the total number of viruses. qRT-PCR results for a representative experiment of three are shown; p values for c-Myc and 4 factors refer to the empty vector or 3 factors, respectively. *, p < 0.05. B, left panel, individual components of miRNA cluster B were divided and infected separately into MEFs overexpressing 3 factors (3F), and the number of GFP+ colonies was counted. Intact cluster B was used as a positive control. Right panel, a similar experiment was performed with overexpression of miR-302b/c/a/d or -367. Intact cluster C was used as a control. D15, day 15. C, the number of GFP+ colonies was counted after transient transfection of the indicated antagomirs in MEFs infected with 3 factors plus miRNA cluster B or C. Representative experiments (of three for each set) are shown. Blank, transfection reagent only; Negative control, sequence that has no match in the mouse.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT)We also investigated how miRNA clusters B and C enhance reprogramming mechanistically. We performed DNA microarray analysis of a time course experiment in which 3 factors and clusters B and C or a control empty vector were overexpressed, and the analysis yielded a large number of differentially expressed genes (supplemental Table S2). These differentially expressed genes did not group into pathways with an obvious connection to reprogramming (supplemental Table S3). However, among those that changed at an early time point (day 4), especially in cluster C, we found genes involved in three relevant processes: the cell cycle, epigenetic modulation, and EMT-MET (e.g. the transcriptional repressor Zeb1, E-cadherin, and occludin) (supplemental Table S4). At later time points, we observed also an increase in Esrrb, Nanog, and UTF1 (supplemental Table S4), which have been implicated in reprogramming. The effect of clusters B and C on cell cycle-related genes is not surprising, as some of the constituent miRNAs belong to the ESC cycle-regulating group (6Wang Y. Baskerville S. Shenoy A. Babiarz J.E. Baehner L. Blelloch R. Nat. Genet. 2008; 40: 1478-1483Crossref PubMed Scopus (542) Google Scholar). We (9Li R. Liang J. Ni S. Zhou T. Qing X. Li H. He W. Chen J. Li F. Zhuang Q. Qin B. Xu J. Li W. Yang J. Gan Y. Qin D. Feng S. Song H. Yang D. Zhang B. Zeng L. Lai L. Esteban M.A. Pei D. Cell Stem Cell. 2010; 7: 51-63Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (894) Google Scholar) and others (14Samavarchi-Tehrani P. Golipour A. David L. Sung H.K. Beyer T.A. Datti A. Woltjen K. Nagy A. Wrana J.L. Cell Stem Cell. 2010; 7: 64-77Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (784) Google Scholar) showed recently that the process of MET (driven mainly by Klf4) coupled to down-regulation of EMT-related genes and TGFβ signaling (mediated mainly by c-Myc) is instrumental for the reprogramming of fibroblasts into iPSCs, but the precise molecular mechanism is not well understood yet. We hypothesized that miRNA cluster C enhances reprogramming at least in part through a MET-related mechanism. First, we explored a putative link between cluster C and MET in silico and found that TGFβR2 is indeed a potential target mRNA of miR-302 members as predicted with the program TargetScan (2Bartel D.P. Cell. 2009; 136: 215-233Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (15577) Google Scholar). TGFβR2 binds TGFβ cytokines and induces EMT through phosphorylation of TGFβR1 and activation of the Smad signaling pathway (9Li R. Liang J. Ni S. Zhou T. Qing X. Li H. He W. Chen J. Li F. Zhuang Q. Qin B. Xu J. Li W. Yang J. Gan Y. Qin D. Feng S. Song H. Yang D. Zhang B. Zeng L. Lai L. Esteban M.A. Pei D. Cell Stem Cell. 2010; 7: 51-63Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (894) Google Scholar). Using a reporter-based assay, we also detected that miR-302d, as a representative component of cluster C, bound to and repressed the 3′-UTR of TGFβR2 (Fig. 3, A and B). This was alleviated by mutating the miRNA-binding site in the 3′-UTR (Fig. 3B). In addition, overexpression of cluster C down-regulated TGFβR2 protein in fibroblasts (Fig. 3C). TargetScan predicted also that miR-20b and -106a can target TGFβR2, but we did not observe protein down-regulation after overexpressing cluster B in MEFs (Fig. 3C). During the time course of reprogramming with 3 factors, cluster C could increase E-cadherin expression compared with cluster B or the control, as assessed by qRT-PCR and Western blotting (Fig. 3, D and E). Interestingly, cluster A could also increase E-cadherin mRNA and protein (Fig. 3, D and E). Immunofluorescence microscopy for E-cadherin and its cytoplasmic partner β-catenin validated that both clusters C and A induce MET (Fig. 3F). E-cadherin induction by clusters A and C was comparable at early time points, but later on, the increase was more marked with cluster C (Fig. 3, D and F). On the other hand, overexpression of a constitutively active form of TGFβR1 (more potently) or TGFβR2 (9Li R. Liang J. Ni S. Zhou T. Qing X. Li H. He W. Chen J. Li F. Zhuang Q. Qin B. Xu J. Li W. Yang J. Gan Y. Qin D. Feng S. Song H. Yang D. Zhang B. Zeng L. Lai L. Esteban M.A. Pei D. Cell Stem Cell. 2010; 7: 51-63Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (894) Google Scholar) attenuated the accelerated MET changes observed with miRNA cluster C and 3 factors (data not shown) and reduced the number of GFP+ colonies (Fig. 3G). This demonstrates that cluster C enhances reprogramming at least in part by targeting TGFβR2. While our manuscript was in preparation, Li et al. (15Li Z. Yang C.S. Nakashima K. Rana T.M. EMBO J. 2011; 30: 823-834Crossref PubMed Scopus (267) Google Scholar) showed that miR-106a/b enhance mouse reprogramming through down-regulation of p21 and TGFβR2. The lack of an obvious effect of cluster B (containing miR-106a) in repressing TGFβR2 in MEFs and in inducing MET during reprogramming in our model may be explained by differences in the delivery method. miR-106a/b and -302 components display similarity in the seed region, but their sequences are not identical (supplemental Fig. S1), which might determine a different affinity for targeting TGFβR2. In this regard, oligonucleotide transfection can likely achieve higher single miRNA expression levels than retroviral delivery of an entire miRNA cluster, thus bypassing potential differences in relative specificity. The lack of effect on colony formation of miRNA cluster A is also puzzling and contrasts with the data of Samavarchi-Tehrani et al. (14Samavarchi-Tehrani P. Golipour A. David L. Sung H.K. Beyer T.A. Datti A. Woltjen K. Nagy A. Wrana J.L. Cell Stem Cell. 2010; 7: 64-77Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (784) Google Scholar). Interestingly, we observed that cluster A seems to improve MET at the start, but the final number of reprogrammed colonies remains unaffected. Samavarchi-Tehrani et al. performed transient transfection, whereas in our work, high expression levels remained constant. In this regard, a recent study by Wellner et al. demonstrated (16Wellner U. Schubert J. Burk U.C. Schmalhofer O. Zhu F. Sonntag A. Waldvogel B. Vannier C. Darling D. zur Hausen A. Brunton V.G. Morton J. Sansom O. Schüler J. Stemmler M.P. Herzberger C. Hopt U. Keck T. Brabletz S. Brabletz T. Nat. Cell Biol. 2009; 11: 1487-1495Crossref PubMed Scopus (1352) Google Scholar) that miR-200 family members target Klf4 and Sox2, and this could explain why miRNA cluster A accelerates the reprogramming up to a certain stage (MET) and then blunts it. Potential targets of cluster A also belong to (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathways not related to cluster C, and this could also derail the process (supplemental Fig. S5 and Table S5). Delivery of cluster A using an inducible system may be a useful way to further study these possibilities. Of note, we also observed increased iPSC clone formation with 3 factors and miR-302–367 in human fibroblasts (supplemental Fig. S6); the effect was not as dramatic as in mouse cells but raises the possibility of further optimization. Lin et al. (11Lin S.L. Chang D.C. Chang-Lin S. Lin C.H. Wu D.T. Chen D.T. Ying S.Y. RNA. 2008; 14: 2115-2124Crossref PubMed Scopus (366) Google Scholar, 17Lin S.L. Chang D.C. Lin C.H. Ying S.Y. Leu D. Wu D.T.S. Nucleic Acids. Res. 2011; 39: 1054-1065Crossref PubMed Scopus (267) Google Scholar) used miR-302 constituents to reprogram human skin cancer cells and hair follicle cells into clones that display similarity to iPSCs. Nevertheless, in the latter study, it is unclear whether the target cells were fibroblasts or a stem cell population, and the colonies did not display human ESC-like morphology (17Lin S.L. Chang D.C. Lin C.H. Ying S.Y. Leu D. Wu D.T.S. Nucleic Acids. Res. 2011; 39: 1054-1065Crossref PubMed Scopus (267) Google Scholar).FIGURE 3miRNA cluster C accelerates epithelium-like changes during reprogramming. A, schematic representation of the TGFβR2 3′-UTR divided into two fragments and cloned into an appropriate luciferase reporter gene. Below the mature sequence for miR-302d, the two binding sites in the UTR and the corresponding mutations are underlined. mmu-miR-302d, Mus musculus miR-302d. B, effect of transiently transfecting miR-302d on the activity of luciferase reporters containing the 3′-UTR of TGFβR2. The 3′-UTR was divided into two fragments (region 1 or 2) that were cloned separately. A representative experiment of three is shown. C, representative Western blot of TGFβR2 in MEFs overexpressing miRNA cluster B or C. β-Actin was used as the loading control. D, qRT-PCR of E-cadherin in MEFs undergoing reprogramming with 3 factors and miRNA cluster A, B, or C. A representative experiment of three measured at days 7 (D7) and 10 (D10) is shown. E, representative Western blots of E-cadherin and β-actin in MEFs undergoing reprogramming with 3 factors (3F) and miRNA cluster A (left panel) or cluster B or C (right panel). Two time points are shown in the right panel. F, immunofluorescence microscopy of E-cadherin and β-catenin in MEFs reprogrammed with 3 factors plus cluster A and C or a control. Scale bars = 500 μm. G, left panel, qRT-PCR of E-cadherin in MEFs reprogrammed with 3 factors plus miR-302d antagomirs or a control (n = 3). Right panel, the number of GFP+ colonies produced in MEFs transduced with 3 factors and miRNA cluster C plus an empty vector, constitutively active TGFβR1 (T204D), or TGFβR2 (n = 6).View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT)In summary, our work describes an alternative method to test miRNA combinations in nuclear reprogramming by exogenous factors and gives mechanistic insight into how the process works (supplemental Fig. S7). Currently, we are testing different miRNA combinations that include existing genomic clusters and artificial mixtures to define additional signaling pathways and to devise strategies that will improve transgene-free reprogramming. For example, the same principle applied recently to produce human iPSCs with modified mRNAs (18Warren L. Manos P.D. Ahfeldt T. Loh Y.H. Li H. Lau F. Ebina W. Mandal P.K. Smith Z.D. Meissner A. Daley G.Q. Brack A.S. Collins J.J. Cowan C. Schlaeger T.M. Rossi D.J. Cell Stem Cell. 2010; 7: 618-630Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1979) Google Scholar) may be applied to deliver miRNA clusters like those described here. Our finding that miR-302 represses TGFβR2 may also be relevant in other settings, e.g. cancer stem cells (19Gunaratne P.H. Curr. Stem Cell Res. Ther. 2009; 4: 168-177Crossref PubMed Scopus (81) Google Scholar). IntroductionPluripotent and differentiated cell fates are determined at least in part by tissue-specific transcription factors that impose a concrete genetic program (1Takahashi K. Yamanaka S. Cell. 2006; 126: 663-676Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (18471) Google Scholar). In addition to coding RNAs, noncoding RNAs (2Bartel D.P. Cell. 2009; 136: 215-233Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (15577) Google Scholar) are an integral part of the genetic programs that specify cell fate, regulating, for example, the expression of key cell-specific transcription factors (3Tay Y. Zhang J. Thomson A.M. Lim B. Rigoutsos I. Nature. 2008; 455: 1124-1128Crossref PubMed Scopus (1129) Google Scholar) and chromatin stability (4van Wolfswinkel J.C. Ketting R.F. J. Cell Sci. 2010; 123: 1825-1839Crossref PubMed Scopus (83) Google Scholar) and therefore cell-specific properties. miRNAs 4The abbreviations used are: miRNA, microRNA; ESC, embryonic stem cell; iPSC, induced pluripotent stem cell; MEF, mouse embryonic fibroblast; TGFβR, TGFβ receptor; qRT, quantitative RT; EMT, epithelial-to-mesenchymal transition; MET, mesenchymal-to-epithelial transition. are 21–23-nucleotide-long noncoding RNAs that, by inducing degradation and/or preventing translation of target mRNAs (2Bartel D.P. Cell. 2009; 136: 215-233Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (15577) Google Scholar), modulate a plethora of cell functions, including those related to ESC self-renewal/differentiation (5Xu N. Papagiannakopoulos T. Pan G. Thomson J.A. Kosik K.S. Cell. 2009; 137: 647-658Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (940) Google Scholar) and cell cycle progression (6Wang Y. Baskerville S. Shenoy A. Babiarz J.E. Baehner L. Blelloch R. Nat. Genet. 2008; 40: 1478-1483Crossref PubMed Scopus (542) Google Scholar). In this context, it is not only expected that miRNAs can enhance reprogramming but also tempting to speculate that, in the right combination, they might be able to reset somatic cells into iPSCs without added factors. Blelloch and co-workers (7Judson R.L. Babiarz J.E. Venere M. Blelloch R. Nat. Biotechnol. 2009; 27: 459-461Crossref PubMed Scopus (588) Google Scholar) observed that, in the original mixture devised by Takahashi and Yamanaka (1Takahashi K. Yamanaka S. Cell. 2006; 126: 663-676Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (18471) Google Scholar), c-Myc can be substituted by components of the miR-290 cluster or by miR-302d. Elimination of c-Myc is desirable because it reduces tumor formation but has a negative effect on reprogramming. However, use of chemically synthesized oligonucleotides involves repeated transfection, and this implies a transient effect, toxicity, and an inability to pool large numbers of miRNAs without reducing their concentration beyond an optimal threshold. The latter is a concern because many ESC-specific miRNAs reside clustered within the same genome locus, and one could argue that delivering some or all these miRNA clusters together should be optimal for producing iPSCs. In this regard, we demonstrate herein that stable overexpression of entire endogenous miRNA clusters can potently improve reprogramming and be an effective tool for mechanistic analysis.

Abstract Single-cell technologies are becoming increasingly widespread and have been revolutionizing our understanding of cell identity, state, diversity and function. However, current platforms can be slow to apply to large-scale studies and resource-limited clinical arenas due to a variety of reasons including cost, infrastructure, sample quality and requirements. Here we report DNBelab C4 (C4), a negative pressure orchestrated, portable and cost-effective device that enables high-throughput single-cell transcriptional profiling. C4 system can efficiently allow discrimination of species-specific cells at high resolution and dissect tissue heterogeneity in different organs, such as murine lung and cerebral cortex. Finally, we show that the C4 system is comparable to existing platforms but has huge benefits in cost and portability and, as such, it will be of great interest for the wider scientific community.

ABSTRACT Stopping COVID-19 is a priority worldwide. Understanding which cell types are targeted by SARS-CoV-2 virus, whether interspecies differences exist, and how variations in cell state influence viral entry is fundamental for accelerating therapeutic and preventative approaches. In this endeavor, we profiled the transcriptome of nine tissues from a Macaca fascicularis monkey at single-cell resolution. The distribution of SARS-CoV-2 facilitators, ACE2 and TMRPSS2, in different cell subtypes showed substantial heterogeneity across lung, kidney, and liver. Through co-expression analysis, we identified immunomodulatory proteins such as IDO2 and ANPEP as potential SARS-CoV-2 targets responsible for immune cell exhaustion. Furthermore, single-cell chromatin accessibility analysis of the kidney unveiled a plausible link between IL6-mediated innate immune responses aiming to protect tissue and enhanced ACE2 expression that could promote viral entry. Our work constitutes a unique resource for understanding the physiology and pathophysiology of two phylogenetically close species, which might guide in the development of therapeutic approaches in humans. Bullet points We generated a single-cell transcriptome atlas of 9 monkey tissues to study COVID-19. ACE2 + TMPRSS2 + epithelial cells of lung, kidney and liver are targets for SARS-CoV-2. ACE2 correlation analysis shows IDO2 and ANPEP as potential therapeutic opportunities. We unveil a link between IL6, STAT transcription factors and boosted SARS-CoV-2 entry.

SUMMARY Spatially resolved transcriptomic technologies are promising tools to study cell fate decisions in a physical microenvironment, which is fundamental for enhancing our knowledge of mammalian development. However, the imbalance between resolution, transcript capture and field of view of current methodologies precludes their systematic application to analyze relatively large and three-dimensional mid- and late-gestation mammalian embryos. Here, we combined DNA nanoball (DNB) patterned arrays and tissue RNA capture to create SpaTial Enhanced REsolution Omics-sequencing (Stereo-seq). This approach allows transcriptomic profiling of large histological sections with high resolution and sensitivity. We have applied Stereo-seq to study the kinetics and directionality of transcriptional variation in a time course of mouse organogenesis. We used this information to gain insight into the molecular basis of regional specification, neuronal migration and differentiation in the developing brain. Furthermore, we mapped the expression of a panel of developmental disease-related loci on our global transcriptomic maps to define the spatiotemporal windows of tissue vulnerability. Our panoramic atlas constitutes an essential resource to investigate longstanding questions concerning normal and abnormal mammalian development.

ABSTRACT Recent technological development in spatial transcriptomics allows researchers to measure gene expression of cells and their spatial locations at the almost single-cell level, which generates detailed biological insight into biological processes. However, specialized spatial transcriptomics databases are rare. Here, we present the Spatial TranscriptOmics DataBase (STOmicsDB), a user-friendly database with multifunctions including search of relevant publications and tools, public dataset visualization, customized specialized databases, new data archive, and online analysis. The current version of STOmicsDB consists of 141 curated spatial transcript datasets covering 12 species, and includes 5,618 spatial multi-omics publications and 674 tools. STOmicsDB is freely accessible at https://db.cngb.org/stomics/ .

Abstract Integrative analysis of multi-omics layers at single cell level is critical for accurate dissection of cell-to-cell variation within certain cell populations. Here we report scCAT-seq, a technique for simultaneously assaying chromatin accessibility and the transcriptome within the same single cell. We show that the combined single cell signatures enable accurate construction of regulatory relationships between cis -regulatory elements and the target genes at single-cell resolution, providing a new dimension of features that helps direct discovery of regulatory patterns specific to distinct cell identities. Moreover, we generated the first single cell integrated maps of chromatin accessibility and transcriptome in human pre-implantation embryos and demonstrated the robustness of scCAT-seq in the precise dissection of master transcription factors in cells of distinct states during embryo development. The ability to obtain these two layers of omics data will help provide more accurate definitions of “single cell state” and enable the deconvolution of regulatory heterogeneity from complex cell populations.

Abstract Global profile of gene expression at single-cell resolution remains to be determined for primates. Using a recently developed technology (“Stereo-seq”), we have obtained a comprehensive single-cell spatial transcriptome map at the whole-brain level for cynomolgus monkeys, with ∼600 genes per cell for 10 μm-thick coronal sections (up to 15 cm 2 in size). Large-scale single-nucleus RNA-seq analysis for ∼1 million cells helped to identify cell types corresponding to Stereo-seq gene expression profiles, providing a 3-D cell type atlas of the monkey brain. Quantitative analysis of Stereo-seq data revealed molecular fingerprints that mark distinct neocortical layers and subregions, as well as domains within subcortical structures including hippocampus, thalamus, striatum, cerebellum, hypothalamus and claustrum. Striking whole-brain topography and coordinated patterns were found in the expression of genes encoding receptors and transporters for neurotransmitters and neuromodulators. These results pave the way for cellular and molecular understanding of organizing principles of the primate brain.

Abstract Solid tumors are complex ecosystems, and heterogeneity is the major challenge for overcoming tumor relapse and metastasis. Uncovering the spatial heterogeneity of cell types and functional states in tumors is essential for developing effective treatment, especially in invasive fronts of tumor, the most active region for tumor cells infiltration and invasion. We firstly used SpaTial Enhanced REsolution Omics-sequencing (Stereo-seq) with a nanoscale resolution to characterize the tumor microenvironment of intrahepatic cholangiocarcinoma (ICC). Enrichment of distinctive immune cells, suppressive immune microenvironment and metabolic reprogramming of tumor cells were identified in the 500µm-wide zone centered bilaterally on the tumor boundary, namely invasive fronts of tumor. Furthermore, we found the damaged states of hepatocytes with overexpression of Serum Amyloid A (SAA) in invasive fronts, recruiting macrophages for facilitating further tumor invasion, and thus resulting in a worse prognosis. We also confirmed these findings in hepatocellular carcinoma and other liver metastatic cancers. Our work highlights the remarkable potential of high-resolution-spatially resolved transcriptomic approaches to provide meaningful biological insights for comprehensively dissecting the tumor ecosystem and guiding the development of novel therapeutic strategies for solid tumors.