Abstract Single cell genomics is rapidly advancing our knowledge of cell phenotypic types and states. Driven by single cell/nucleus RNA sequencing (scRNA-seq) data, comprehensive atlas projects covering a wide range of organisms and tissues are currently underway. As a result, it is critical that the cell transcriptional phenotypes discovered are defined and disseminated in a consistent and concise manner. Molecular biomarkers have historically played an important role in biological research, from defining immune cell-types by surface protein expression to defining diseases by molecular drivers. Here we describe a machine learning-based marker gene selection algorithm, NS-Forest version 2.0, which leverages the non-linear attributes of random forest feature selection and a binary expression scoring approach to discover the minimal marker gene expression combinations that precisely captures the cell type identity represented in the complete scRNA-seq transcriptional profiles. The marker genes selected provide a barcode of the necessary and sufficient characteristics for semantic cell type definition and serve as useful tools for downstream biological investigation. The use of NS-Forest to identify marker genes for human brain middle temporal gyrus cell types reveals the importance of cell signaling and non-coding RNAs in neuronal cell type identity.

Summary Viral genetic tools to target specific brain cell types in humans and non-genetic model organisms will transform basic neuroscience and targeted gene therapy. Here we used comparative epigenetics to identify thousands of human neuronal subclass-specific putative enhancers to regulate viral tools, and 34% of these were conserved in mouse. We established an AAV platform to evaluate cellular specificity of functional enhancers by multiplexed fluorescent in situ hybridization (FISH) and single cell RNA sequencing. Initial testing in mouse neocortex yields a functional enhancer discovery success rate of over 30%. We identify enhancers with specificity for excitatory and inhibitory classes and subclasses including PVALB, LAMP5, and VIP/LAMP5 cells, some of which maintain specificity in vivo or ex vivo in monkey and human neocortex. Finally, functional enhancers can be proximal or distal to cellular marker genes, conserved or divergent across species, and could yield brain-wide specificity greater than the most selective marker genes.

Abstract Human cortical interneurons have been challenging to study due to high diversity and lack of mature brain tissue platforms and genetic targeting tools. We employed rapid GABAergic neuron viral labeling plus unbiased Patch-seq sampling in brain slices to define the signature morpho-electric properties of GABAergic neurons in the human neocortex. Viral targeting greatly facilitated sampling of the SST subclass, including primate specialized double bouquet cells which mapped to two SST transcriptomic types. Multimodal analysis uncovered an SST neuron type with properties inconsistent with original subclass assignment; we instead propose reclassification into PVALB subclass. Our findings provide novel insights about functional properties of human cortical GABAergic neuron subclasses and types and highlight the essential role of multimodal annotation for refinement of emerging transcriptomic cell type taxonomies. One Sentence Summary Viral genetic labeling of GABAergic neurons in human ex vivo brain slices paired with Patch-seq recording yields an in-depth functional annotation of human cortical interneuron subclasses and types and highlights the essential role of multimodal functional annotation for refinement of emerging transcriptomic cell type taxonomies.

Abstract Neocortical layer 1 (L1) is a site of convergence between pyramidal neuron dendrites and feedback axons where local inhibitory signaling can profoundly shape cortical processing. Evolutionary expansion of human neocortex is marked by distinctive pyramidal neuron types with extensive branching in L1, but whether L1 interneurons are similarly diverse is underexplored. Using patch-seq recordings from human neurosurgically resected tissues, we identified four transcriptomically defined subclasses, unique subtypes within those subclasses and additional types with no mouse L1 homologue. Compared with mouse, human subclasses were more strongly distinct from each other across all modalities. Accompanied by higher neuron density and more variable cell sizes compared with mouse, these findings suggest L1 is an evolutionary hotspot, reflecting the increasing demands of regulating the expanding human neocortical circuit. One Sentence Summary Using transcriptomics and morpho-electric analyses, we describe innovations in human neocortical layer 1 interneurons.

1. Abstract This paper reviews efforts across 16 international consortia to construct human anatomical structures, cell types, and biomarkers (ASCT+B) tables and three-dimensional reference organs in support of a Human Reference Atlas. We detail the ontological descriptions and spatial three-dimensional anatomical representations together with user interfaces that support the registration and exploration of human tissue data. Four use cases are presented to demonstrate the utility of ASCT+B tables for advancing biomedical research and improving health.

Abstract The human cerebral cortex has tremendous cellular diversity and complex cellular organization that are essential for brain function. How different types of cells are organized and interact with each other in the human cortex, and how cellular organizations and interaction patterns vary across species are, however, unclear. Here, we performed spatially resolved single-cell expression profiling of 4,000 genes in human middle and superior temporal gyrus using multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization (MERFISH). We identified >100 neuronal and non-neuronal cell populations with distinct transcriptional signatures, generated a molecularly defined and spatially resolved cell atlas of these brain regions, and analyzed cell-cell interactions in a cell-type-specific manner. Comparison with the mouse cortex showed conservation in the laminar organization of cells and substantial divergence in cell-cell interactions between human and mouse. Notably, our data revealed a drastic increase in interactions between neurons and non-neuronal cells in the human cortex, uncovered human-specific cell-cell interaction patterns, and identified potential ligand-receptor basis of microglia-neuron interactions.

Summary Seeking new insights into the homeostasis, modulation and plasticity of cortical synaptic networks, we have analyzed results from a single-cell RNA-seq study of 22,439 mouse neocortical neurons. Our analysis exposes transcriptomic evidence for dozens of molecularly distinct neuropeptidergic modulatory networks that directly interconnect all cortical neurons. This evidence begins with a discovery that transcripts of one or more neuropeptide precursor (NPP) and one or more neuropeptide-selective G-protein-coupled receptor (NP-GPCR) genes are highly abundant in all, or very nearly all, cortical neurons. Individual neurons express diverse subsets of NP signaling genes from palettes encoding 18 NPPs and 29 NP-GPCRs. These 47 genes comprise 37 cognate NPP/NP-GPCR pairs, implying the likelihood of local neuropeptide signaling. Here we use neuron-type-specific patterns of NP gene expression to offer specific, testable predictions regarding 37 peptidergic neuromodulatory networks that may play prominent roles in cortical homeostasis and plasticity. Impact Single-cell mRNA sequencing data from mouse neocortex expose evidence for peptidergic neuromodulatory networks that locally interconnect every cortical neuron Data Highlights At least 97% of mouse neocortical neurons express one or more of 18 neuropeptide precursor proteins (NPP) genes at very high levels At least 98% of cortical neurons express one or more of 29 neuropeptide-selective G-protein-coupled receptor (NP-GPCR) genes cognate to the 18 highly expressed NPP genes Neocortical expression of these 18 NPP and 29 NP-GPCR genes is highly neuron-type-specific and their expression patterns differentiate transcriptomic neuron types with exceptional power Neuron-type taxonomy and type-specific expression of 37 cognate NPP / NP-GPCR gene pairs generate testable predictions of at least 37 local intracortical neuromodulation networks

Abstract Consistent identification of neurons in different experimental modalities is a key problem in neuroscience. While methods to perform multimodal measurements in the same set of single neurons have become available, parsing complex relationships across different modalities to uncover neuronal identity is a growing challenge. Here, we present an optimization framework to learn coordinated representations of multimodal data, and apply it to a large multimodal dataset profiling mouse cortical interneurons. Our approach reveals strong alignment between transcriptomic and electrophysiological characterizations, enables accurate cross-modal data prediction, and identifies cell types that are consistent across modalities. Highlights Coupled autoencoders for multimodal assignment, Analysis of Patch-seq data consisting of more than 3000 cells

Abstract Characterizing cellular diversity at different levels of biological organization across data modalities is a prerequisite to understanding the function of cell types in the brain. Classification of neurons is also required to manipulate cell types in controlled ways, and to understand their variation and vulnerability in brain disorders. The BRAIN Initiative Cell Census Network (BICCN) is an integrated network of data generating centers, data archives and data standards developers, with the goal of systematic multimodal brain cell type profiling and characterization. Emphasis of the BICCN is on the whole mouse brain and demonstration of prototypes for human and non-human primate (NHP) brains. Here, we provide a guide to the cellular and spatial approaches employed, and to accessing and using the BICCN data and its extensive resources, including the BRAIN Cell Data Center (BCDC) which serves to manage and integrate data across the ecosystem. We illustrate the power of the BICCN data ecosystem through vignettes highlighting several BICCN analysis and visualization tools. Finally, we present emerging standards that have been developed or adopted by the BICCN toward FAIR (Wilkinson et al. 2016a) neuroscience. The combined BICCN ecosystem provides a comprehensive resource for the exploration and analysis of cell types in the brain.

Abstract Large-scale single-cell ‘omics profiling is revolutionising our understanding of cell types in complex organs like the brain, where it is being used to define a complete catalogue of cell types, something that traditional methods struggle with due to the diversity and complexity of the brain. But this poses a problem. How do we organise such a catalogue - providing a standard way to refer to the cell types discovered, linking their classification and properties to supporting data? Cell ontologies provide a solution to recording definitions, classifications, and properties of cell types and provide standard identifiers for annotation, but they currently do not support the data driven cell type definitions and classifications needed for multi-modal single cell ‘omics profiling. Here we describe the construction and application of a semi-automated, data-linked extension to the Cell Ontology that represents cell types in the Primary Motor Cortex of humans, mice and marmosets. The methods and resulting ontology are designed to be scalable and applicable to similar whole brain atlases currently in preparation.