Presented is an overview of the image-analysis software platform Fiji, a distribution of ImageJ that updates the underlying ImageJ architecture and adds modern software design elements to expand the capabilities of the platform and facilitate collaboration between biologists and computer scientists. Fiji is a distribution of the popular open-source software ImageJ focused on biological-image analysis. Fiji uses modern software engineering practices to combine powerful software libraries with a broad range of scripting languages to enable rapid prototyping of image-processing algorithms. Fiji facilitates the transformation of new algorithms into ImageJ plugins that can be shared with end users through an integrated update system. We propose Fiji as a platform for productive collaboration between computer science and biology research communities.

We present TrackMate, an open source Fiji plugin for the automated, semi-automated, and manual tracking of single-particles. It offers a versatile and modular solution that works out of the box for end users, through a simple and intuitive user interface. It is also easily scriptable and adaptable, operating equally well on 1D over time, 2D over time, 3D over time, or other single and multi-channel image variants. TrackMate provides several visualization and analysis tools that aid in assessing the relevance of results. The utility of TrackMate is further enhanced through its ability to be readily customized to meet specific tracking problems. TrackMate is an extensible platform where developers can easily write their own detection, particle linking, visualization or analysis algorithms within the TrackMate environment. This evolving framework provides researchers with the opportunity to quickly develop and optimize new algorithms based on existing TrackMate modules without the need of having to write de novo user interfaces, including visualization, analysis and exporting tools. The current capabilities of TrackMate are presented in the context of three different biological problems. First, we perform Caenorhabditis-elegans lineage analysis to assess how light-induced damage during imaging impairs its early development. Our TrackMate-based lineage analysis indicates the lack of a cell-specific light-sensitive mechanism. Second, we investigate the recruitment of NEMO (NF-κB essential modulator) clusters in fibroblasts after stimulation by the cytokine IL-1 and show that photodamage can generate artifacts in the shape of TrackMate characterized movements that confuse motility analysis. Finally, we validate the use of TrackMate for quantitative lifetime analysis of clathrin-mediated endocytosis in plant cells.

The first community competition designed to objectively compare the performance of particle tracking algorithms provides valuable practical information for both users and developers. Particle tracking is of key importance for quantitative analysis of intracellular dynamic processes from time-lapse microscopy image data. Because manually detecting and following large numbers of individual particles is not feasible, automated computational methods have been developed for these tasks by many groups. Aiming to perform an objective comparison of methods, we gathered the community and organized an open competition in which participating teams applied their own methods independently to a commonly defined data set including diverse scenarios. Performance was assessed using commonly defined measures. Although no single method performed best across all scenarios, the results revealed clear differences between the various approaches, leading to notable practical conclusions for users and developers.

Blebs are spherical membrane protrusions often observed during cell migration, cell spreading, cytokinesis, and apoptosis, both in cultured cells and in vivo. Bleb expansion is thought to be driven by the contractile actomyosin cortex, which generates hydrostatic pressure in the cytoplasm and can thus drive herniations of the plasma membrane. However, the role of cortical tension in bleb formation has not been directly tested, and despite the importance of blebbing, little is known about the mechanisms of bleb growth. In order to explore the link between cortical tension and bleb expansion, we induced bleb formation on cells with different tensions. Blebs were nucleated in a controlled manner by laser ablation of the cortex, mimicking endogenous bleb nucleation. Cortical tension was modified by treatments affecting the level of myosin activity or proteins regulating actin turnover. We show that there is a critical tension below which blebs cannot expand. Above this threshold, the maximal size of a bleb strongly depends on tension, and this dependence can be fitted with a model of the cortex as an active elastic material. Together, our observations and model allow us to relate bleb shape parameters to the underlying cellular mechanics and provide insights as to how bleb formation can be biochemically regulated during cell motility.

Nuclear factor κB (NF-κB) essential modulator (NEMO), a regulatory component of the IκB kinase (IKK) complex, controls NF-κB activation through its interaction with ubiquitin chains. We show here that stimulation with interleukin-1 (IL-1) and TNF induces a rapid and transient recruitment of NEMO into punctate structures that are anchored at the cell periphery. These structures are enriched in activated IKK kinases and ubiquitinated NEMO molecules, which suggests that they serve as organizing centers for the activation of NF-κB. These NEMO-containing structures colocalize with activated TNF receptors but not with activated IL-1 receptors. We investigated the involvement of nondegradative ubiquitination in the formation of these structures, using cells deficient in K63 ubiquitin chains or linear ubiquitin chain assembly complex (LUBAC)-mediated linear ubiquitination. Our results indicate that, unlike TNF, IL-1 requires K63-linked and linear ubiquitin chains to recruit NEMO into higher-order complexes. Thus, different mechanisms are involved in the recruitment of NEMO into supramolecular complexes, which appear to be essential for NF-κB activation.

TrackMate is an automated tracking software used to analyze bioimages and is distributed as a Fiji plugin. Here, we introduce a new version of TrackMate. TrackMate 7 is built to address the broad spectrum of modern challenges researchers face by integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. We illustrate qualitatively and quantitatively that these new capabilities function effectively across a wide range of bio-imaging experiments. TrackMate 7 combines the benefits of machine and deep learning-based image segmentation with accurate object tracking to enable improved 2D and 3D tracking of diverse objects in biological research.

Single-particle tracking microscopy is a powerful technique to investigate how proteins dynamically interact with their environment in live cells. However, the analysis of tracks is confounded by noisy molecule localization, short tracks, and rapid transitions between different motion states, notably between immobile and diffusive states. Here, we propose a probabilistic method termed ExTrack that uses the full spatio-temporal information of tracks to extract global model parameters, to calculate state probabilities at every time point, to reveal distributions of state durations, and to refine the positions of bound molecules. ExTrack works for a wide range of diffusion coefficients and transition rates, even if experimental data deviate from model assumptions. We demonstrate its capacity by applying it to slowly diffusing and rapidly transitioning bacterial envelope proteins. ExTrack greatly increases the regime of computationally analyzable noisy single-particle tracks. The ExTrack package is available in ImageJ and Python.

The ability of cells to migrate is a fundamental physiological process involved in embryonic development, tissue homeostasis, immune surveillance, and wound healing. Therefore, the mechanisms governing cellular locomotion have been under intense scrutiny over the last 50 years. One of the main tools of this scrutiny is live-cell quantitative imaging, where researchers image cells over time to study their migration and quantitatively analyze their dynamics by tracking them using the recorded images. Despite the availability of computational tools, manual tracking remains widely used among researchers due to the difficulty setting up robust automated cell tracking and large-scale analysis. Here we provide a detailed analysis pipeline illustrating how the deep learning network StarDist can be combined with the popular tracking software TrackMate to perform 2D automated cell tracking and provide fully quantitative readouts. Our proposed protocol is compatible with both fluorescent and widefield images. It only requires freely available and open-source software (ZeroCostDL4Mic and Fiji), and does not require any coding knowledge from the users, making it a versatile and powerful tool for the field. We demonstrate this pipeline’s usability by automatically tracking cancer cells and T cells using fluorescent and brightfield images. Importantly, we provide, as supplementary information, a detailed step-by-step protocol to allow researchers to implement it with their images.

Abstract HIV integration occurs in chromatin sites that favor the release of high levels of viral progeny, alternatively the virus is also able to discreetly coexist with the host. The viral infection perturbs the cellular environment inducing the remodeling of the nuclear landscape. Indeed, HIV-1 triggers the nuclear clustering of the host factor CPSF6, but the underlying mechanism is poorly understood. Our data indicate that HIV usurps a recently discovered biological phenomenon, called liquid-liquid phase separation (LLPS), to hijack the host cell. We observed CPSF6 clusters as part of HIV-induced membraneless organelles (HIV-1 MLOs) in macrophages, which are one of the main HIV target cells. We describe that HIV-1 MLOs follow phase separation rules and represent functional biomolecular condensates. We highlight HIV-1 MLOs as hubs of nuclear reverse transcription, while the double stranded viral DNA, once formed, rapidly migrates outside these structures. Transcription-competent proviruses localize outside, but near HIV-1 MLOs, in LEDGF-abundant regions, known to be active chromatin sites. Therefore, HIV-1 MLOs orchestrate viral events prior to the integration step and create a favorable environment for the viral replication. This study uncovers single functional host-viral complexes in their nuclear landscape, which is markedly restructured by HIV-1.