Summary Terminating the SARS-CoV-2 pandemic relies upon pan-global vaccination. Current vaccines elicit neutralizing antibody responses to the virus spike derived from early isolates. However, new strains have emerged with multiple mutations: P.1 from Brazil, B.1.351 from South Africa and B.1.1.7 from the UK (12, 10 and 9 changes in the spike respectively). All have mutations in the ACE2 binding site with P.1 and B.1.351 having a virtually identical triplet: E484K, K417N/T and N501Y, which we show confer similar increased affinity for ACE2. We show that, surprisingly, P.1 is significantly less resistant to naturally acquired or vaccine induced antibody responses than B.1.351 suggesting that changes outside the RBD impact neutralisation. Monoclonal antibody 222 neutralises all three variants despite interacting with two of the ACE2 binding site mutations, we explain this through structural analysis and use the 222 light chain to largely restore neutralization potency to a major class of public antibodies.

Summary Some COVID-19 patients are unable to clear their infection or are at risk of severe disease, requiring treatment with neutralising monoclonal antibodies (nmAb) and/or antivirals. The rapid roll-out of novel therapeutics means there is limited understanding of the likely genetic barrier to drug resistance. Unprecedented genomic surveillance of SARS-CoV-2 in the UK has enabled a genome-first approach to the detection of emerging drug resistance. Here we report the accrual of mutations in Delta and Omicron cases treated with casirivimab+imdevimab and sotrovimab respectively. Mutations occur within the epitopes of the respective nmAbs. For casirivimab+imdevimab these are present on contiguous raw reads, simultaneously affecting both components. Using surface plasmon resonance and pseudoviral neutralisation assays we demonstrate these mutations reduce or completely abrogate antibody affinity and neutralising activity, suggesting they are driven by immune evasion. In addition, we show that some mutations also reduce the neutralising activity of vaccine-induced serum.

Summary Immune responses to primary COVID‐19 vaccination were investigated in 58 patients with follicular lymphoma (FL) as part of the PETReA trial of frontline therapy (EudraCT 2016–004010‐10). COVID‐19 vaccines (BNT162b2 or ChAdOx1) were administered before, during or after cytoreductive treatment comprising rituximab (depletes B cells) and either bendamustine (depletes CD4 + T cells) or cyclophosphamide‐based chemotherapy. Blood samples obtained after vaccine doses 1 and 2 (V1, V2) were analysed for antibodies and T cells reactive to the SARS‐CoV‐2 spike protein using the Abbott Architect and interferon‐gamma ELISpot assays respectively. Compared to 149 healthy controls, patients with FL exhibited lower antibody but preserved T‐cell responses. Within the FL cohort, multivariable analysis identified low pre‐treatment serum IgA levels and V2 administration during induction or maintenance treatment as independent determinants of lower antibody and higher T‐cell responses, and bendamustine and high/intermediate FLIPI‐2 score as additional determinants of a lower antibody response. Several clinical scenarios were identified where dichotomous immune responses were estimated with >95% confidence based on combinations of predictive variables. In conclusion, the immunogenicity of COVID‐19 vaccines in FL patients is influenced by multiple disease‐ and treatment‐related factors, among which B‐cell depletion showed differential effects on antibody and T‐cell responses.

Abstract mRNA vaccine technologies introduced following the SARS-CoV-2 pandemic have highlighted the need to better understand the interaction of adjuvants and the early innate immune response. Interferon type I (IFN-I) is an integral part of this early innate response and can prime several components of the adaptive immune response. Females are widely reported to respond better than males to seasonal tri- and quad-valent influenza vaccines. Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are the primary cell type responsible for IFN-I production and female pDCs produce more IFN-I than male pDCs since the upstream receptor TLR7 is encoded by the X-chromosome and is biallelically expressed by up to 30% of female immune cells. Additionally, the TLR7 promoter contains putative androgen response elements and androgens have been reported to suppress pDC IFN-I in-vitro . Unexpectedly, therefore, we recently observed that male adolescents mount stronger antibody responses to the Pfizer BNT162b2 mRNA vaccine than female adolescents after controlling for natural SARS-CoV-2 infection. We here examined pDC behaviour in this cohort to determine the impact of IFN-I on anti-Spike and anti-receptor-binding domain titres to BNT162b2. Through LASSO modelling we determined that serum free testosterone was associated with reduced pDC IFN-I but, contrary to the well-described immunosuppressive role for androgens, the more potent androgen dihydrotestosterone was associated with increased IgG titres to BNT162b2. Also unexpectedly, we observed that co-vaccination with live-attenuated influenza vaccine boosted the magnitude of IgG responses to BNT162b2. Together these data support a model where systemic IFN-I increased vaccine-mediated immune responses, but for vaccines with intracellular stages, modulation of the local IFN-I response may alter antigen longevity and consequently vaccine-driven immunity. Author Summary Type I interferons (IFN-I) are potent antiviral proteins which play a central role in activating the immune response and driving inflammation. IFN-I is predominantly produced by plasmacytoid dendritic cells (pDCs) and female pDCs produce more IFN-I than male pDCs. Consequently, females typically generate stronger antibody responses to vaccines such as seasonal influenza vaccines. In addition, females typically suffer more serious adverse events from vaccines. However, we recently reported in a study of adolescents that males generate stronger antibody responses to the SARS-CoV-2 mRNA vaccine BNT162b2 than females. Here we examine the IFN-I response of pDCs in adolescents co-/vaccinated with BNT162b2 and live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We find that male sex hormones reduce pDC IFN-I but are associated with increased BNT162b2 antibody titres. We also observe that LAIV boosts BNT162b2 antibody titres through possible bystander activation of immune cells. These findings are consistent with a reportedly higher incidence of adverse events among males associated with this vaccine. Together these data suggest that IFN-I production typically enhances vaccine-specific immune responses but for new mRNA vaccines such as BNT162b2, that are modified to reduce innate immunogenicity, localised dampening of the IFN-I response in vaccinated tissue by male sex hormones may further delay the clearance of the vaccine, increasing vaccine antigen exposure and allowing time for a stronger antibody response.

Summary Background The soil bacterium Burkholderia pseudomallei is the causative agent of melioidosis. It kills up to 40% of cases and contributes to human morbidity and mortality in many tropical and sub-tropical countries. As no vaccines are currently available, prevention is the key health policy and is achieved by avoiding direct contact with soil and standing water. The pathogen notoriously persists in ranges of environmental conditions which make disease prevention difficult. We aimed to scan B. pseudomallei genomes for signals of evolutionary adaptations that allow it to thrive across environmental conditions, which should ultimately inform prevention policy. Methods We conducted three layers of analyses: a genome-wide epistasis and co-selection study (GWES) on 2,011 B. pseudomallei genomes to detect signals of co-selection; gene expression analyses across 82 diverse physical, chemical, biological and infectious conditions to identify specific conditions in which such selection might have acted; and gene knockout assays to confirm the function of the co-selection hotspot. Findings We uncovered 13,061 mutation pairs in distinct genes and non-coding RNA that have been repeatedly co-selected through B. pseudomallei evolution. Genes under co-selection displayed marked expression correlation when B. pseudomallei was subjected to physical stress conditions including temperature stress, osmotic stress, UV radiation, and nutrient deprivation; highlighting these conditions as the major evolutionary driving forces for this bacterium. We identified a putative adhesin ( BPSL1661 ) as a hub of co-selection signals, experimentally confirmed the role of BPSL1661 under nutrient deprivation, and explored the functional basis of the co-selection gene network surrounding BPSL1661 in facilitating bacterial survival under nutrient depletion. Interpretation Our findings suggest that B. pseudomallei has a selective advantage to survive nutrient-limited conditions. Anthropogenic activities such as shifting cultivation systems with more frequent rotations of cropping and shortened fallow periods or continuous cultivation of cash crops could directly or indirectly contribute to loss of soil nutrient; these may lead to the preferential survival of B. pseudomallei and a subsequent rise of melioidosis. Successful disease control for melioidosis needs to consider improving environmental health in addition to current preventive efforts. Funding Wellcome Trust, European Research Council, UK Department of Health, Thailand Research Fund and Khon Kaen University Research in context Evidence before this study We searched PubMed with terms (co-selection AND bacteria AND population) with no date or language restrictions from database inception until April 11, 2021. We identified 44 publications of which four were conducted at a genome-wide scale. These four studies were performed on human-restricted pathogens, detected co-selection of antibiotic resistance gene networks which highlight the use of antibiotics as major selection pressures and further inform treatment options. However, none of these studies were performed on Burkholderia pseudomallei or other opportunistic pathogens that have been adapted to both natural and host environments. The selection pressures exerted on these pathogens and the genetic determinants allowed for their adaptations remain unclear, which limit our understanding on the bacterial biology and the information used for disease control. Added value of this study Based on genomes of 2,011 B. pseudomallei collected from melioidosis endemic areas, we identified and confirmed genetic signals for co-selection. Using transcriptome profiling covering a broad spectrum of conditions and exposures, we showed that genes under co-selection displayed marked expression correlation under physical stress conditions with the gene at the co-selection hotspot conditionally expressed under nutrient starvation. Furthermore, we experimentally validated the function of the hotspot gene and demonstrated that unlike host-restricted pathogens, the B. pseudomallei co-selection network does not facilitate host infection but is focused on bacterial survival in a harsh environment, particularly under nutrient depletion. Aside from providing a data resource, the study also showcases the power of combined genetics, transcriptomics and functional analysis as a tool for biology discovery. Implications of all available evidence Our findings provide evolutionary and biological evidence for preferential survival of B. pseudomallei under nutrient starvation. Agricultural practice that induces soil loss, which is not uncommon in melioidosis endemic areas has been linked to soil nutrient depletion and may contribute to the prevalence of B. pseudomallei and a consequent rise of melioidosis in these regions. Successful melioidosis control has to consider environmental health in addition to existing prevention policy.

Abstract Germinal centre (GC) B cells undergo proliferation at very high rates in a hypoxic microenvironment, but the cellular processes driving this are incompletely understood. Here we show that the mitochondria of GC B cells are highly dynamic, with significantly upregulated transcription and translation rates associated with the activity of transcription factor mitochondrial A (TFAM). TFAM, whilst also necessary for normal B cell development, is required for entry of activated GC-precursor B cells into the germinal centre reaction, and deletion of Tfam significantly impairs GC formation, function, and output. Loss of TFAM in B cells compromises the actin cytoskeleton and impairs cellular motility of GC B cells in response to chemokine signalling, leading to their spatial disorganisation. We show that B cell lymphoma substantially increases mitochondrial translation, and deletion of Tfam in B cells is protective against the development of lymphoma in a c-Myc transgenic model. Finally, we show that pharmacologic inhibition of mitochondrial transcription and translation inhibits growth of GC-derived human lymphoma cells, and induces similar defects in the actin cytoskeleton.

Abstract Background Assessment of cellular immune responses by combining intracellular cytokine staining and immunophenotyping using flow cytometry enables the simultaneous measurement of T cell phenotype and effector function in response to pathogens and vaccines. The use of whole blood samples rather than peripheral blood mononuclear cells avoids both the need for immediate processing and loss of functional antigen presenting cells due to processing and cryopreservation. Using whole blood provides the possibility to stimulate peripheral T cells in situ , and is more suitable for studies where sample volume is limited, such as those involving children, the elderly and critically ill patients. The aim of this study was to provide a robust tool for the assessment of antigen-specific T cell responses in a field site setting with limited resources. Methodology/Principle Findings We optimised a flow cytometry-based whole blood intracellular cytokine assay (WBA) with respect to duration of antigen stimulation and intracellular protein retention time. We demonstrate the ability of the WBA to capture polyfunctional T cell responses in the context of acute scrub typhus infection, by measuring IFN-γ, TNF and IL-2 in CD4+ and CD8+ T cells in response to the causative agent O. tsutsugamushi (OT). Using an optimised OT antigen preparation, we demonstrate the presence of polyfunctional antigen-specific memory CD4+ T cells in the blood of scrub typhus patients. Conclusions/Significance In conclusion, this flow cytometry-based WBA is well-suited for use at field study sites, and enables the assessment of polyfunctional T cell responses to infectious agents and vaccines through delineation of antigen-specific cytokine secretion at the single cell level. Author summary Scrub typhus is an acute febrile illness caused by the bite of infected chigger mites transmitting O. tsutsugamushi, a gramnegative obligate intracellular bacteria in the family Rickettsiaceae . The disease progression and clinical manifestations are closely associated with host immune responses. T cell responses are in strong relation with immune protection against scrub typhus. As there is limited knowledge on specific T cell roles against scrub typhus, we optimized a flow-cytometer based protocol to assess O. tsutsugumushi -specific T cell responses in whole blood samples, which is suitable for studies in limited resource settings. This method requires low blood volumes, but enables multiparametric immunophenotyping assessments. The optimized WBA protocol could be a useful tool for comprehensive immunopathological studies in scrub typhus, and other infectious diseases as well as vaccine studies in areas with limited availability of specialized equipment, while reliably capturing the complexity of the immune response.

SUMMMARY Melioidosis is a fatal disease caused by Burkholderia pseudomallei Gram-negative bacteria. It is the causative of 89,000 deaths per year in endemic areas of Southeast Asia and Northern Australia. Diabetes mellitus is the most risk factor, increasing 12-fold the susceptibility for severe disease. IFN-γ responses from CD4 and CD8 T cells, but also from NK and NKT cells are necessary to eliminate the pathogen. Elucidating the immune correlates of protection of our previously described protective BpOmpW vaccine is an essential step of any vaccine before clinical trials. Thus, we immunized non-insulin resistant C57BL/6j mice and an insulin resistant C57BL/6j mouse model of Type 2 Diabetes (T2D) with BpOmpW using Sigma Adjuvant System (SAS) (treatment) or SAS only (control). Two weeks later bloods and spleens were collected and serological analysis & in vitro exposure of splenocytes to the antigen for 60 hours were performed in both controls and treatment groups to finally analyze the stained splenocytes by flow cytometry. BpOmpW induced strong antibody response, stimulated effector CD4 + and CD8 + T cells and CD4 + CD25 + Foxp3 + regulatory T cells and produced higher IFN-γ responses in CD4 + , CD8 + , NK and NKT cells relative to the control group in non-insulin resistant mice. T cell responses of insulin resistant mice to BpOmpW were comparable to those in non-insulin resistant mice. In addition, as a precursor to its evaluation in human studies, humanised HLA-DR and HLA-DQ transgenic mice elicited IFN-γ recall responses in an ELISPoT-based study and PBMCs from donors that were in contact to BpOmpW for seven days experienced T cell proliferation. Finally, plasma from melioidosis survivors with diabetes recognized our BpOmpW vaccine antigen. Overall, these range of approaches used strongly indicate that BpOmpW elicits the required immune correlates of protection to combat melioidosis and bring the vaccine closer to clinical trials.

Germinal centre (GC) B cells proliferate at some of the highest rates of any mammalian cell, yet the metabolic processes which enable this are poorly understood. We performed integrated metabolomic and transcriptomic profiling of GC B cells, and found that metabolism of the non-essential amino acid asparagine (Asn) was highly upregulated. Asn was conditionally essential to B cells, and its synthetic enzyme, asparagine synthetase (ASNS) was markedly upregulated following their activation, through the integrated stress response sensor general control non-derepressible 2 (GCN2). When Asns is deleted, GC formation, and B cell survival in low Asn conditions were severely impaired, and removal of environmental Asn by asparaginase or dietary restriction markedly compromised the GC reaction. Using stable isotope tracing, we found that metabolic adaptation to the absence of Asn requires ASNS, and that oxidative phosphorylation, mitochondrial homeostasis, and synthesis of nucleotides was particularly sensitive to Asn deprivation. Altogether, we reveal that Asn metabolism acts as a key regulator of B cell function and GC homeostasis.

Abstract COVID-19 is an ongoing global crisis in which the development of effective vaccines and therapeutics will depend critically on understanding the natural immunity to the virus, including the role of SARS-CoV-2-specific T cells. We have conducted a study of 42 patients following recovery from COVID-19, including 28 mild and 14 severe cases, comparing their T cell responses to those of 16 control donors. We assessed the immune memory of T cell responses using IFNγ based assays with overlapping peptides spanning SARS-CoV-2 apart from ORF1. We found the breadth, magnitude and frequency of memory T cell responses from COVID-19 were significantly higher in severe compared to mild COVID-19 cases, and this effect was most marked in response to spike, membrane, and ORF3a proteins. Total and spike-specific T cell responses correlated with the anti-Spike, anti-Receptor Binding Domain (RBD) as well as anti-Nucleoprotein (NP) endpoint antibody titre (p<0.001, <0.001 and =0.002). We identified 39 separate peptides containing CD4 + and/or CD8 + epitopes, which strikingly included six immunodominant epitope clusters targeted by T cells in many donors, including 3 clusters in spike (recognised by 29%, 24%, 18% donors), two in the membrane protein (M, 32%, 47%) and one in the nucleoprotein (Np, 35%). CD8+ responses were further defined for their HLA restriction, including B*4001-restricted T cells showing central memory and effector memory phenotype. In mild cases, higher frequencies of multi-cytokine producing M- and NP-specific CD8 + T cells than spike-specific CD8 + T cells were observed. They furthermore showed a higher ratio of SARS-CoV-2-specific CD8 + to CD4 + T cell responses. Immunodominant epitope clusters and peptides containing T cell epitopes identified in this study will provide critical tools to study the role of virus-specific T cells in control and resolution of SARS-CoV-2 infections. The identification of T cell specificity and functionality associated with milder disease, highlights the potential importance of including non-spike proteins within future COVID-19 vaccine design.