Ligand-dependent activation of transcription by nuclear receptors (NRs) is mediated by interactions with coactivators. Receptor agonists promote coactivator binding, and antagonists block coactivator binding. Here we report the crystal structure of the human estrogen receptor alpha (hER alpha) ligand-binding domain (LBD) bound to both the agonist diethylstilbestrol (DES) and a peptide derived from the NR box II region of the coactivator GRIP1 and the crystal structure of the hER alpha LBD bound to the selective antagonist 4-hydroxytamoxifen (OHT). In the DES-LBD-peptide complex, the peptide binds as a short alpha helix to a hydrophobic groove on the surface of the LBD. In the OHT-LBD complex, helix 12 occludes the coactivator recognition groove by mimicking the interactions of the NR box peptide with the LBD. These structures reveal the two distinct mechanisms by which structural features of OHT promote this "autoinhibitory" helix 12 conformation.

Extracellular ATP activates cell-surface metabotropic and ionotropic nucleotide (P2) receptors in vascular, neural, connective, and immune tissues. These P2 receptors mediate a wealth of physiological processes, including nitric oxide-dependent vasodilation of vascular smooth muscle and fast excitatory neurotransmission in sensory afferents. Although ATP is now recognized as a signaling molecule, the cellular and molecular mechanisms underlying its actions have been difficult to study due to the absence of selective P2 receptor antagonists and cloned receptor genes. Nonetheless, five mammalian P2 receptor subtypes have been tentatively assigned based solely on agonist specificity and signaling properties. Here we report the cloning of a mouse cDNA encoding a P2 receptor that shares striking homology with several G protein-coupled peptide receptors. When expressed in Xenopus laevis oocytes, the cloned receptor resembles a metabotropic P2U receptor; activation by either ATP or UTP elicits the mobilization of intracellular calcium. mRNA encoding the P2U purinergic receptor is found in neural and nonneural tissues.

In eukaryotes, the ubiquitous and abundant members of the 90 kilodalton heat-shock protein (hsp90) chaperone family facilitate the folding and conformational changes of a broad array of proteins important in cell signaling, proliferation, and survival. Here we describe the effects of nucleotides on the structure of full-length HtpG, the Escherichia coli hsp90 ortholog. By electron microscopy, the nucleotide-free, AMPPNP bound, and ADP bound states of HtpG adopt completely distinct conformations. Structural characterization of nucleotide-free and ADP bound HtpG was extended to higher resolution by X-ray crystallography. In the absence of nucleotide, HtpG exhibits an “open” conformation in which the three domains of each monomer present hydrophobic elements into the large cleft formed by the dimer. By contrast, ADP binding drives dramatic conformational changes that allow these hydrophobic elements to converge and shield each other from solvent, suggesting a mechanism by which nucleotides could control client protein binding and release.

Giving an old organelle the old heave-ho Centrioles are ancient cellular organelles that build centrosomes, the major microtubule-organizing centers in animal cells. Duplication of centrioles is tightly controlled to ensure that each dividing cell has precisely two centrosomes. Human cancer cells often have extra centrosomes, which has been hypothesized to confer a proliferative advantage. Wong et al. developed small molecules (centrinones) that allowed them to reversibly “delete” centrioles from cells (see the Perspective by Stearns). Surprisingly, cancer cells continued to divide in the absence of centrosomes, whereas normal cells stopped dividing. Science , this issue p. 1155 ; see also p. 1091

Identification of the cis-regulatory elements controlling cell-type specific gene expression patterns is essential for understanding the origin of cellular diversity. Conventional assays to map regulatory elements via open chromatin analysis of primary tissues is hindered by sample heterogeneity. Single cell analysis of accessible chromatin (scATAC-seq) can overcome this limitation. However, the high-level noise of each single cell profile and the large volume of data pose unique computational challenges. Here, we introduce SnapATAC, a software package for analyzing scATAC-seq datasets. SnapATAC dissects cellular heterogeneity in an unbiased manner and map the trajectories of cellular states. Using the Nyström method, SnapATAC can process data from up to a million cells. Furthermore, SnapATAC incorporates existing tools into a comprehensive package for analyzing single cell ATAC-seq dataset. As demonstration of its utility, SnapATAC is applied to 55,592 single-nucleus ATAC-seq profiles from the mouse secondary motor cortex. The analysis reveals ~370,000 candidate regulatory elements in 31 distinct cell populations in this brain region and inferred candidate cell-type specific transcriptional regulators.

Abstract L eucine R ich R epeat K inase 2 ( LRRK2 ) is the most commonly mutated gene in familial Parkinson’s disease. LRRK2 is proposed to function in membrane trafficking and co-localizes with microtubules. We report the 3.5Å structure of the catalytic half of LRRK2, and an atomic model of microtubule-associated LRRK2 built using a reported 14Å cryo-electron tomography in situ structure. We propose that the conformation of LRRK2’s kinase domain regulates its microtubule interaction, with a closed conformation favoring binding. We show that the catalytic half of LRRK2 is sufficient for microtubule binding and blocks the motility of the microtubule-based motors kinesin and dynein in vitro . Kinase inhibitors that stabilize an open conformation relieve this interference and reduce LRRK2 filament formation in cells, while those that stabilize a closed conformation do not. Our findings suggest that LRRK2 is a roadblock for microtubule-based motors and have implications for the design of therapeutic LRRK2 kinase inhibitors.

Abstract Mitotic duration is tightly constrained, with extended mitotic duration being a characteristic of potentially problematic cells prone to chromosome missegregation and genomic instability. We show that memories of mitotic duration are integrated by a p53-based mitotic stopwatch pathway to exert tight control over proliferation. The stopwatch halts proliferation of the products of a single significantly extended mitosis or of successive modestly extended mitoses. Time in mitosis is monitored via mitotic kinase-regulated assembly of stopwatch complexes that are transmitted to daughter cells. The stopwatch is inactivated in p53-mutant cancers, as well as in a significant proportion of p53-wildtype cancers, consistent with classification of stopwatch complex subunits as tumor suppressors. Stopwatch status additionally influences efficacy of anti-mitotic agents currently used or in development for cancer therapy. One-Sentence Summary Time spent in mitosis is carefully monitored to halt the proliferation of potentially dangerous cells in a population.

Mammalian tissues are composed of highly specialized cell types defined by distinct gene expression patterns. Identification of cis -regulatory elements responsible for cell-type specific gene expression is essential for understanding the origin of the cellular diversity. Conventional assays to map cis -elements via open chromatin analysis of primary tissues fail to resolve their cell type specificity and lack the sensitivity to identify cis -elements in rare cell types. Single nucleus analysis of transposase-accessible chromatin (ATAC-seq) can overcome this limitation, but current analysis methods begin with pre-defined genomic regions of accessibility and are therefore biased toward the dominant population of a tissue. Here we report a method, Single Nucleus Analysis Pipeline for ATAC-seq (SnapATAC), that can efficiently dissect cellular heterogeneity in an unbiased manner using single nucleus ATAC-seq datasets and identify candidate regulatory sequences in constituent cell types. We demonstrate that SnapATAC outperforms existing methods in both accuracy and scalability. We further analyze 64,795 single cell chromatin profiles from the secondary motor cortex of mouse brain, creating a chromatin landscape atlas with unprecedent resolution, including over 300,000 candidate cis -regulatory elements in nearly 50 distinct cell populations. These results demonstrate a systematic approach for comprehensive analysis of cis -regulatory sequences in the mammalian genomes.

ABSTRACT Centromeres are epigenetically defined by the presence of the centromere-specific histone H3 variant CENP-A. A specialized loading machinery, including the histone chaperone HJURP/Scm3, participates in CENP-A nucleosome assembly. However, Scm3/HJURP is missing from multiple lineages, including nematodes, which rely on a CENP-A-dependent centromere. Here, we show that the extended N-terminal tail of C. elegans CENP-A contains a predicted structured region that is essential for centromeric chromatin assembly. Removal of this region of the CENP-A N-Tail prevents loading, resulting in failure of kinetochore assembly and defective chromosome condensation. By contrast, the N-Tail mutant CENP-A localizes normally in the presence of endogenous CENP-A. The portion of the N-Tail containing the predicted structured region binds to KNL-2, a conserved SANTA and Myb domain-containing protein (referred to as M18BP1 in vertebrates), that is specifically involved in CENP-A chromatin assembly. This direct interaction is conserved in the related nematode C. briggsae, despite divergence of the N-Tail and KNL-2 primary sequences. Thus, the extended N-Tail of CENP-A is essential for CENP-A chromatin assembly in C. elegans and partially substitutes for the function of Scm3/HJURP, in that it mediates an interaction of the specialized histone fold of CENP-A with KNL-2. These results highlight an evolutionary variation on centromeric chromatin assembly in the absence of a dedicated CENP-A-specific chaperone/targeting factor of the Scm3/HJURP family.