ABSTRACT The coronavirus main protease, M pro , is a key protein in the virus life cycle and a major drug target. Based on crystal structures of SARSCoV2 M pro complexed with peptidomimetic inhibitors, we recognized a binding characteristic shared with proline-containing inhibitors of hepatitis C virus protease. Initial tests showed that this subclass of HCV protease inhibitors indeed exhibited activity against M pro . Postulating a benefit for a preorganized backbone conformation, we designed new ketoamide-based M pro inhibitors based on central proline rings. One of the designed compounds, ML1000, inhibits M pro with low-nanomolar affinity and suppresses SARSCoV2 viral replication in human cells at sub-micromolar concentrations. Our findings identify ML1000 as a promising new pre-organized scaffold for the development of anti-coronavirus drugs.

ABSTRACT K777 is a di-peptide analog that contains an electrophilic vinyl-sulfone moiety and is a potent, covalent inactivator of cathepsins. Vero E6, HeLa/ACE2, Caco-2, A549/ACE2, and Calu-3, cells were exposed to SARS-CoV-2, and then treated with K777. K777 reduced viral infectivity with EC 50 values of inhibition of viral infection of: 74 nM for Vero E6, <80 nM for A549/ACE2, and 4 nM for HeLa/ACE2 cells. In contrast, Calu-3 and Caco-2 cells had EC 50 values in the low micromolar range. No toxicity of K777 was observed for any of the host cells at 10-100 μM inhibitor. K777 did not inhibit activity of the papain-like cysteine protease and 3CL cysteine protease, encoded by SARS-CoV-2 at concentrations of ≤ 100 μM. These results suggested that K777 exerts its potent anti-viral activity by inactivation of mammalian cysteine proteases which are essential to viral infectivity. Using a propargyl derivative of K777 as an activity-based probe, K777 selectively targeted cathepsin B and cathepsin L in Vero E6 cells. However only cathepsin L cleaved the SARS-CoV-2 spike protein and K777 blocked this proteolysis. The site of spike protein cleavage by cathepsin L was in the S1 domain of SARS-CoV-2, differing from the cleavage site observed in the SARS CoV-1 spike protein. These data support the hypothesis that the antiviral activity of K777 is mediated through inhibition of the activity of host cathepsin L and subsequent loss of viral spike protein processing. SIGNIFICANCE The virus causing COVID-19 is highly infectious and has resulted in a global pandemic. We confirm that a cysteine protease inhibitor, approved by the FDA as a clinical-stage compound, inhibits SARS-CoV-2 infection of several human and monkey cell lines with notable(nanomolar) efficacy. The mechanism of action of this inhibitor is identified as a specific inhibition of host cell cathepsin L. This in turn inhibits host cell processing of the coronaviral spike protein, a step required for cell entry. Neither of the coronaviral proteases are inhibited, and the cleavage site of spike protein processing is different from that reported in other coronaviruses. Hypotheses to explain the differential activity of the inhibitor with different cell types are discussed.

Abstract The main protease (M pro ) of SARS-CoV-2, the pathogen responsible for the COVID-19 pandemic, is a key antiviral drug target. While most SARS-CoV-2 M pro inhibitors have a γ-lactam glutamine surrogate at the P1 position, we recently discovered several M pro inhibitors have hydrophobic moieties at the P1 site, including calpain inhibitors II/XII, which are also active against human cathepsin L, a host-protease that is important for viral entry. To determine the binding mode of these calpain inhibitors and establish a structure-activity relationship, we solved X-ray crystal structures of M pro in complex with calpain inhibitors II and XII, and three analogues of GC-376 , one of the most potent M pro inhibitors in vitro . The structure of M pro with calpain inhibitor II confirmed the S1 pocket of M pro can accommodate a hydrophobic methionine side chain, challenging the idea that a hydrophilic residue is necessary at this position. Interestingly, the structure of calpain inhibitor XII revealed an unexpected, inverted binding pose where the P1’ pyridine inserts in the S1 pocket and the P1 norvaline is positioned in the S1’ pocket. The overall conformation is semi-helical, wrapping around the catalytic core, in contrast to the extended conformation of other peptidomimetic inhibitors. Additionally, the structures of three GC-376 analogues UAWJ246 , UAWJ247 , and UAWJ248 provide insight to the sidechain preference of the S1’, S2, S3 and S4 pockets, and the superior cell-based activity of the aldehyde warhead compared with the α-ketoamide. Taken together, the biochemical, computational, structural, and cellular data presented herein provide new directions for the development of M pro inhibitors as SARS-CoV-2 antivirals.

Abstract As the COVID-19 pandemic continues to fold out, the morbidity and mortality are increasing daily. Effective treatment for SARS-CoV-2 is urgently needed. We recently discovered four SARS-CoV-2 main protease (M pro ) inhibitors including boceprevir, calpain inhibitors II and XII and GC-376 with potent antiviral activity against infectious SARS-CoV-2 in cell culture. Despite the weaker enzymatic inhibition of calpain inhibitors II and XII against M pro compared to GC-376, calpain inhibitors II and XII had more potent cellular antiviral activity. This observation promoted us to hypothesize that the cellular antiviral activity of calpain inhibitors II and XII might also involve the inhibition of cathepsin L in addition to M pro . To test this hypothesis, we tested calpain inhibitors II and XII in the SARS-CoV-2 pseudovirus neutralization assay in Vero E6 cells and found that both compounds significantly decreased pseudoviral particle entry into cells, indicating their role in inhibiting cathepsin L. The involvement of cathepsin L was further confirmed in the drug time-of-addition experiment. In addition, we found that these four compounds not only inhibit SARS-CoV-2, but also SARS-CoV, MERS-CoV, as well as human coronaviruses (CoVs) 229E, OC43, and NL63. The mechanism of action is through targeting the viral M pro , which was supported by the thermal shift binding assay and enzymatic FRET assay. We further showed that these four compounds have additive antiviral effect when combined with remdesivir. Altogether, these results suggest that boceprevir, calpain inhibitors II and XII, and GC-376 are not only promising antiviral drug candidates against existing human coronaviruses, but also might work against future emerging CoVs.

Abstract Respiratory viral infections, especially Influenza (endemic) or SARS-CoV-2 (pandemic since 2020), cause morbidity and mortality worldwide. Despite remarkable progress in the development and deployment of vaccines, they are clearly impacted by the rapid emergence of viral variants. The development of an off-the-shelf, effective, safe, and low-cost drug for prophylaxis against respiratory viral infections is a major unmet medical need. Here, we developed NanoSTING, a liposomally encapsulated formulation of the endogenous STING agonist, 2’-3’ cGAMP, to function as an immunoantiviral. NanoSTING rapidly activates the body’s innate immune system to facilitate a broad-spectrum antiviral response against SARS-CoV-2 and influenza variants in hamsters and mice. We demonstrate that a single intranasal dose of NanoSTING can: (1) treat infections throughout the respiratory system and minimize clinical symptoms, (2) protect against highly pathogenic strains of SARS-CoV-2 (alpha and delta), (3) provide durable protection against reinfection from the same strains without the need for retreatment, (4) prevent transmission of the highly infectious SARS-CoV-2 Omicron strain, and (5) provide protection against both oseltamivir-sensitive and resistant strains of influenza. Mechanistically, administration of NanoSTING rapidly upregulated interferon-stimulated and antiviral pathways in both the nasal turbinates and lung. Our results support using NanoSTING as a thermostable, immunoantiviral with broad-spectrum antiviral properties making it appealing as a therapeutic for prophylactic or early post-exposure treatment.

ABSTRACT Immunization programs against SARS-CoV-2 with commercial intramuscular (IM) vaccines prevent disease but not infections. The continued evolution of variants of concern (VOC) like Delta and Omicron has increased infections even in countries with high vaccination coverage. This is due to commercial vaccines being unable to prevent viral infection in the upper airways and exclusively targeting the spike (S) protein that is subject to continuous evolution facilitating immune escape. Here we report a multi-antigen, intranasal vaccine, NanoSTING-NS that yields sterilizing immunity and leads to the rapid and complete elimination of viral loads in both the lungs and the nostrils upon viral challenge with SARS-CoV-2 VOC. We formulated vaccines with the S and nucleocapsid (N) proteins individually to demonstrate that immune responses against S are sufficient to prevent disease whereas combination immune responses against both proteins prevents viral replication in the nasal compartment. Studies with the highly infectious Omicron VOC showed that even in vaccine-naïve animals, a single dose of NanoSTING-NS significantly reduced transmission. These observations have two implications: (1) mucosal multi-antigen vaccines present a pathway to preventing transmission and ending the pandemic, and (2) an explanation for why hybrid immunity in humans is superior to vaccine-mediated immunity by current IM vaccines.

ABSTRACT Background Inhaled budesonide benefits patients with COVID-19. ProLung™-budesonide enables the sustained, low dose administration of budesonide within a delivery vehicle similar to lung surfactant. ProLung™-budesonide may offer anti-inflammatory and protective effects to the lung in COVID-19, yet it’s effect on SARS-CoV-2 replication is unknown. Objective To determine the efficacy of ProLung™-budesonide against SARS-CoV-2 infection in vitro, evaluate its ability to decrease inflammation, and airway hyperresponsiveness in an animal model of lung inflammation. Methods SARS-CoV-2-infected Vero 76 cells were treated with ProLung™-budesonide ([0.03– 100 μg/ml]) for 3 days, and virus yield in the supernatant was measured. Ovalbumin-sensitized C57BL/6 mice received aerosolized (a) ProLung™-budesonide weekly, (b) only budesonide, either daily or weekly, or (c) weekly empty ProLung™-carrier (without budesonide). All treatment groups were compared to sensitized untreated, or normal mice using histopathologic examination, electron microscopy (EM), airway hyperresponsiveness (AHR) to Methacholine (Mch) challenge, and eosinophil peroxidase activity (EPO) measurements in bronchioalveolar lavage (BAL). Results ProLung™-budesonide showed significant inhibition on viral replication of SARS-CoV-2-infected cells with the selectivity index (SI) value > 24. Weekly ProLung™-budesonide and daily budesonide therapy significantly decreased lung inflammation and EPO in BAL. ProLung™-budesonide localized in type II pneumocytes, and was the only group to significantly decrease AHR, and EPO in BAL with Mch challenge Conclusions ProLung™-budesonide significantly inhibited viral replication in SARS-CoV-2 infected cells. It localized into type II pneumocytes, decreased lung inflammation, AHR and EPO activity with Mch challenge. This novel drug formulation may offer a potential inhalational treatment for COVID-19.

Abstract To identify potential therapeutic stop-gaps for SARS-CoV-2, we evaluated a library of 1,670 approved and reference compounds in an unbiased, cellular image-based screen for their ability to suppress the broad impacts of the SARS-CoV-2 virus on phenomic profiles of human renal cortical epithelial cells using deep learning. In our assay, remdesivir is the only antiviral tested with strong efficacy, neither chloroquine nor hydroxychloroquine have any beneficial effect in this human cell model, and a small number of compounds not currently being pursued clinically for SARS-CoV-2 have efficacy. We observed weak but beneficial class effects of β-blockers, mTOR/PI3K inhibitors and Vitamin D analogues and a mild amplification of the viral phenotype with β-agonists.

Abstract Acute flaccid myelitis (AFM) leads to loss of limb control in young children and is likely due to Enterovirus-D68 (EV-D68), for which there is no current treatment. We have developed a lead isoxazole-3-carboxamide analog of pleconaril (11526092) which displayed potent inhibition of the pleconaril-resistant CVB3-Woodruff (IC 50 6-20 nM), EV-D68 (IC 50 58 nM), and other enteroviruses. A mouse respiratory model of EV-D68 infection, in which pleconaril is inactive, showed decreased viremia of 3 log units as well as statistically significant 1 log reduction in lung titer reduction at day 5 after treatment with 11526092. A cryo-electron microscopy (cryo-EM) structure of EV-D68 in complex with 11526092 suggests that the increased potency may be due to additional hydrophobic interactions. Cryo-EM structures of 11526092 and pleconaril demonstrate destabilization of EV-D68 (MO strain) compared to the previously described stabilization of EV-D68 (Fermon strain) with pleconaril, illustrating clear strain dependent mechanisms of this molecule. 11526092 represents a more potent inhibitor in vitro with in vivo efficacy providing a potential future treatment for EV-D68 and AFM, suggesting an improvement over pleconaril for further optimization. One-Sentence Summary 11526092 demonstrates protein destabilization, improved in vitro potency and in vivo efficacy when compared with pleconaril against EV-D68.

A novel coronavirus SARS-CoV-2, also called novel coronavirus 2019 (nCoV-19), started to circulate among humans around December 2019, and it is now widespread as a global pandemic. The disease caused by SARS-CoV-2 virus is called COVID-19, which is highly contagious and has an overall mortality rate of 6.4% as of April 15, 2020. There is no vaccine or antiviral available for SARS-CoV-2. In this study, we report our discovery of inhibitors targeting the SARS-CoV-2 main protease (Mpro). Using the FRET-based enzymatic assay, several inhibitors including boceprevir, GC-376, calpain inhibitors II, XII, and MG-132 were identified to have potent activity with single-digit to submicromolar IC50 values in the enzymatic assay. The mechanism of action of the hits was further characterized using enzyme kinetic studies and thermal shift binding assays. Significantly, four compounds (boceprevir, GC-376, calpain inhibitors II and XII) inhibit SARS-CoV-2 viral replication in cell culture with EC50 values ranging from 0.49 to 3.37 micromolar. Notably, boceprevir, calpain inhibitors II and XII represent novel chemotypes that are distinct from known Mpro inhibitors. Overall, the compounds identified herein provide promising starting points for the further development of SARS-CoV-2 therapeutics.### Competing Interest StatementJ. W. and C. M. are inventors of a pending patent that claims the use of the identified compounds for COVID-19.