The composition of the gut microbiome has been associated with clinical responses to immune checkpoint inhibitor (ICI) treatment, but there is limited consensus on the specific microbiome characteristics linked to the clinical benefits of ICIs. We performed shotgun metagenomic sequencing of stool samples collected before ICI initiation from five observational cohorts recruiting ICI-naive patients with advanced cutaneous melanoma (n = 165). Integrating the dataset with 147 metagenomic samples from previously published studies, we found that the gut microbiome has a relevant, but cohort-dependent, association with the response to ICIs. A machine learning analysis confirmed the link between the microbiome and overall response rates (ORRs) and progression-free survival (PFS) with ICIs but also revealed limited reproducibility of microbiome-based signatures across cohorts. Accordingly, a panel of species, including Bifidobacterium pseudocatenulatum, Roseburia spp. and Akkermansia muciniphila, associated with responders was identified, but no single species could be regarded as a fully consistent biomarker across studies. Overall, the role of the human gut microbiome in ICI response appears more complex than previously thought, extending beyond differing microbial species simply present or absent in responders and nonresponders. Future studies should adopt larger sample sizes and take into account the complex interplay of clinical factors with the gut microbiome over the treatment course.

Abstract Metagenomic assembly enables novel organism discovery from microbial communities, but from most metagenomes it can only capture few abundant organisms. Here, we present a method - MetaPhlAn 4 - to integrate information from both metagenome assemblies and microbial isolate genomes for improved and more comprehensive metagenomic taxonomic profiling. From a curated collection of 1.01M prokaryotic reference and metagenome-assembled genomes, we defined unique marker genes for 26,970 species-level genome bins, 4,992 of them taxonomically unidentified at the species level. MetaPhlAn 4 explains ∼20% more reads in most international human gut microbiomes and >40% in less-characterized environments such as the rumen microbiome, and proved more accurate than available alternatives on synthetic evaluations while also reliably quantifying organisms with no cultured isolates. Application of the method to >24,500 metagenomes highlighted previously undetected species to be strong biomarkers for host conditions and lifestyles in human and mice microbiomes, and showed that even previously uncharacterized species can be genetically profiled at the resolution of single microbial strains. MetaPhlAn 4 thus integrates the novelty of metagenomic assemblies with the sensitivity and fidelity of reference-based analyses, providing efficient metagenomic profiling of uncharacterized species and enabling deeper and more comprehensive microbiome biomarker detection.

Abstract Prevotella copri is a common inhabitant of the human gut. Interest in P. copri has gathered pace due to conflicting reports on whether it is beneficial or detrimental to health. In a cross-continent meta-analysis exploiting >6,500 available metagenomes supported by new isolate sequencing and recovery of high-quality genomes from metagenomes, we obtained >1,000 P. copri genomes. This 100-fold increase over existing isolate genomes allowed the genetic and global population structure of P. copri to be explored at an unprecedented depth. We demonstrate P. copri is not a monotypic species, but encompasses four distinct clades (>10% inter-clade vs. <4% intra-clade average single nucleotide variants) for which we propose the name P. copri complex, comprising clades A, B, C and D. We show the complex is near ubiquitous in non-Westernised populations (95.4% versus 29.6% in Westernised populations), where all four clades are typically co-present within an individual (61.6% of the cases), in contrast to Westernised populations (4.6%). Genomic analysis of the complex reveals substantial and complementary functional diversity, including the potential for utilisation of complex carbohydrates, suggestive that multi-generational dietary modifications may be a driver for the reduced P. copri prevalence in Westernised populations. Analysis of ancient stool microbiomes highlights a similar pattern of P. copri presence consistent with modern non-Westernised populations, allowing us to estimate the time of clade delineation to pre-date human migratory waves out of Africa. Our analysis reveals P. copri to be far more diverse than previously appreciated and this diversity appears to be underrepresented in Western-lifestyle populations.

Abstract The gut microbiome starts to be shaped in the first days of life and continues to increase its diversity during the first months. Several investigations are assessing the link between the configuration of the infant gut microbiome and infant health, but a comprehensive strain-level assessment of vertically transmitted microbes from mother to infant is still missing. We longitudinally collected fecal and breast milk samples from multiple mother-infant pairs during the first year of life, and applied shotgun metagenomic sequencing followed by strain-level profiling. We observed several specific strains including those from Bifidobacterium bifidum , Coprococcus comes , and Ruminococcus bromii , that were present in samples from the same mother-infant pair, while being clearly distinct from those carried by other pairs, which is indicative of vertical transmission. We further applied metatranscriptomics to study the in vivo expression of vertically transmitted microbes, for example Bacteroides vulgatus and Bifidobacterium spp., thus suggesting that transmitted strains are functionally active in the two rather different environments of the adult and infant guts. By combining longitudinal microbiome sampling and newly developed computational tools for strain-level microbiome analysis, we showed that it is possible to track vertical transmission of members of the microbiome from mother to infants and characterize their transcriptional activity. Our work poses the basis for surveying at larger scale the sources of microbial diversity in the infants and starts associating these transmissions with the subsequent longer-term development of a healthy or dysbiotic microbiome. Importance Early infant exposure is important in the acquisition and ultimate development of a healthy infant microbiome. There is increasing support that the maternal microbial reservoir is a key route of microbial transmission, yet much is inferred from the observation of shared species in mother and infant. Common species, per se , does not necessarily equate vertical transmission as species exhibit considerable strain heterogeneity and it is therefore imperative to identify shared strains. We demonstrate here the potential of shotgun metagenomics and strain-level resolution to identify vertical transmission events via the maternal source. Combined with a metatranscriptomic approach, we show the potential not only to identify and track the fate of microbes in the early infant microbiome but also identify the metabolically active members. These approaches will ultimately provide important insights into the acquisition, development and community dynamics of the infant microbiome.

Microbial colonization of the neonatal gut involves maternal seeding, which is partially disrupted in cesarean-born infants and after intrapartum antibiotic prophylaxis. However, other physically close individuals could complement such seeding. To assess the role of both parents and of induced seeding, we analyzed two longitudinal metagenomic datasets (health and early life microbiota [HELMi]: N = 74 infants, 398 samples, and SECFLOR: N = 7 infants, 35 samples) with cesarean-born infants who received maternal fecal microbiota transplantation (FMT). We found that the father constitutes a stable source of strains for the infant independently of the delivery mode, with the cumulative contribution becoming comparable to that of the mother after 1 year. Maternal FMT increased mother-infant strain sharing in cesarean-born infants, raising the average bacterial empirical growth rate while reducing pathogen colonization. Overall, our results indicate that maternal seeding is partly complemented by that of the father and support the potential of induced seeding to restore potential deviations in this process.

Abstract Cultivation-free metagenomic analysis afforded unprecedented details on the diversity, structure and potential functions of microbial communities in different environments. When employed to study the viral fraction of the community that is recalcitrant to cultivation, metagenomics can shed light into the diversity of viruses and their role in natural ecosystems. However, despite the increasing interest in virome metagenomics, methodological issues still hinder the proper interpretation and comparison of results across studies. Virome enrichment experimental protocols are key multi-step processes needed for separating and concentrating the viral fraction from the whole microbial community prior to sequencing. However, there is little information on their efficiency and their potential biases. To fill this gap, we used metagenomic and amplicon sequencing to examine the microbial community composition through the serial filtration and concentration steps commonly used to produce viral-enriched metagenomes. The analyses were performed on water and sediment samples from an Alpine lake. We found that, although the diversity of the retained microbial communities declined progressively during the serial filtration, the final viral fraction contained a large proportion (from 10% to 40%) of non-viral taxa, and that the efficacy of filtration showed biases based on taxonomy. Our results quantified the amount of bacterial genetic material in viromes and highlighted the influence of sample type on the enrichment efficacy. Moreover, since viral-enriched samples contained a significant portion of microbial taxa, computational sequence analysis should account for such biases in the downstream interpretation pipeline. Importance Filtration is a commonly used method to enrich viral particles in environmental samples. However, there is little information on its efficiency and potential biases on the final result. Using a sequence-based analysis on water and sediment samples, we found that filtration efficacy is dependent on sample type and that the final virome contained a large proportion of non-viral taxa. Our finding stressed the importance of downstream analysis to avoid biased interpretation of data.

Abstract Cryptosporidium parvum is a global zoonoses and a major cause of diarrhoea in humans and ruminants. The parasite’s life cycle comprises an obligatory sexual phase, during which genetic exchanges can occur between previously isolated lineages. Here, we compare 32 whole genome sequences from human- and ruminant-derived parasite isolates collected across Europe, Egypt and China. We identify three strongly supported clusters that comprise a mix of isolates from different host species, geographic origins, and subtypes. We show that: (1) recombination occurs between ruminant isolates into human isolates; (2) these recombinant regions can be passed on to other human subtypes through gene flow and population admixture; (3) there have been multiple genetic exchanges, and all are likely recent; (4) putative virulence genes are significantly enriched within these genetic exchanges, and (5) this results in an increase in their nucleotide diversity. We carefully dissect the phylogenetic sequence of two genetic exchanges, illustrating the long-term evolutionary consequences of these events. Our results suggest that increased globalisation and close human-animal contacts increase the opportunity for genetic exchanges between previously isolated parasite lineages, resulting in spillover and spillback events. We discuss how this can provide a novel substrate for natural selection at genes involved in host-parasite interactions, thereby potentially altering the dynamic coevolutionary equilibrium in the Red Queens arms race. Data Summary All raw and processed sequencing data generated and analysed during the current study have been submitted to the NCBI Sequence Read Archive ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/ ), under BioProjects PRJNA634014 and PRJNA633764.

Abstract The gut microbiome plays a key role in cancer immunity. One proposed mechanism is through the elicitation of T cells, which incidentally recognize neo-epitopes arising from cancer mutations (“molecular mimicry (MM)” hypothesis). To support MM, Escherichia coli Nissle was engineered with the SIINFEKL epitope (OVA) and orally administered to C57BL/6 mice. The treatment elicited OVA-specific CD8 + T cells in the lamina propria and inhibited the growth of OVA-B16F10 tumors. Importantly, the administration of Outer Membrane Vesicles (OMVs) engineered with different T cell epitopes elicited epitope-specific T cells and inhibited tumor growth. Microbiome shotgun sequencing and TCR sequencing provided evidence that cross-reacting T cells were induced at the mucosal level and subsequently reached the tumor site. Overall, our data support the role of MM in tumor immunity, assign a new role to OMVs and pave the way to new probiotics/OMV-based anti-cancer immunotherapies.

Abstract Culture-independent analyses of microbial communities have advanced dramatically in the last decade, particularly due to advances in methods for biological profiling via shotgun metagenomics. Opportunities for improvement continue to accelerate, with greater access to multi-omics, microbial reference genomes, and strain-level diversity. To leverage these, we present bioBakery 3, a set of integrated, improved methods for taxonomic, strain-level, functional, and phylogenetic profiling of metagenomes newly developed to build on the largest set of reference sequences now available. Compared to current alternatives, MetaPhlAn 3 increases the accuracy of taxonomic profiling, and HUMAnN 3 improves that of functional potential and activity. These methods detected novel disease-microbiome links in applications to CRC (1,262 metagenomes) and IBD (1,635 metagenomes and 817 metatranscriptomes). Strain-level profiling of an additional 4,077 metagenomes with StrainPhlAn 3 and PanPhlAn 3 unraveled the phylogenetic and functional structure of the common gut microbe Ruminococcus bromii , previously described by only 15 isolate genomes. With open-source implementations and cloud-deployable reproducible workflows, the bioBakery 3 platform can help researchers deepen the resolution, scale, and accuracy of multi-omic profiling for microbial community studies.