Abstract The human genome contains more than 200,000 gene isoforms. However, different isoforms can be highly similar, and with an average length of 1.5kb remain difficult to study with short read sequencing. To systematically evaluate the ability to study the transcriptome at a resolution of individual isoforms we profiled 5 human cell lines with short read cDNA sequencing and Nanopore long read direct RNA, amplification-free direct cDNA, PCR-cDNA sequencing. The long read protocols showed a high level of consistency, with amplification-free RNA and cDNA sequencing being most similar. While short and long reads generated comparable gene expression estimates, they differed substantially for individual isoforms. We find that increased read length improves read-to-transcript assignment, identifies interactions between alternative promoters and splicing, enables the discovery of novel transcripts from repetitive regions, facilitates the quantification of full-length fusion isoforms and enables the simultaneous profiling of m6A RNA modifications when RNA is sequenced directly. Our study demonstrates the advantage of long read RNA sequencing and provides a comprehensive resource that will enable the development and benchmarking of computational methods for profiling complex transcriptional events at isoform-level resolution.

Acute Myeloid Leukemia (AML) is a highly lethal blood cancer arising due to aberrant differentiation of haematopoietic stem cells. MEIS1 and HOXA9 regulate stemness-related transcriptional programs in normal haematopoietic stem cells and AML. Here we obtained 3D genome organization maps in the CD34+ haematopoietic stem cells from 3 healthy individuals and 3 individuals with AML. The MEIS1 oncogenic transcription factor is regulated by a Frequently Interacting Region (FIRE). This FIRE is present in normal bone marrow samples, and an AML sample with high MEIS1 levels. However, it is absent in two AML samples that show low MEIS1 levels. CRISPR excision of the FIRE led to loss of MEIS1 and reduced cell growth. Moreover, MEIS1 can bind to the promoter of HOXA9, and HOXA9 can also auto-regulate by binding to its own promoter as well as an Acute Myeloid Leukemia-specific super-enhancer that interacts with the HOXA9 promoter via chromatin interactions.### Competing Interest StatementM.J.F declares two patents on methodologies related to ChIA-PET. No other conflicts of interest are declared.

Natural killer/ T-cell lymphoma (NKTL) patients failing L-asparaginase regimens have extremely poor treatment outcomes. Previous case series showed promising activity when relapsed or refractory NKTL patients were treated with anti-programmed death 1 (PD1) inhibitors. Here, we continue to unravel the molecular profiles with whole-genome sequencing (WGS) on an extended cohort of 11 pembrolizumab-treated patients (median age at diagnosis, 42 years; range, 27-66 years) with a median follow-up of 11 months (range, 2 - 25 months) since starting anti-PD1 therapy. Seven patients achieved complete response (CR) and four patients had progressive disease (PD). Using WGS, we found structural rearrangements of the PD-L1 gene, JAK3-activating mutations and ARID1B homozygous insertion in four, two and one of the CR patient's tumors, respectively. Interesting, these alterations, especially PD-L1 rearrangements, were absent in the four PD cases. Expression of PD1 ligand (PD-L1) was strong in nine patients (5 CR and 4 PD cases) and weak in two patients (both CR). PD1 blockade with pembrolizumab was a potent strategy for NKTL patients and genomic screening could potentially accompany PD-L1 immunohistochemical screening to better select patients for anti-PD1 therapy.

Cyclin Dependent Kinase 9 (CDK9) associates with Bromodomain and Extra-Terminal Domain (BET) proteins to promote transcriptional elongation by phosphorylation of serine 2 of RNAP II C-terminal domain. We examined the therapeutic potential of selective CDK9 inhibitors (AZD 4573 and MC180295) against human multiple myeloma cells in vitro. Short-hairpin RNA silencing of CDK9 in Multiple Myeloma (MM) cell lines reduced cell viability compared to control cells showing the dependency of MM cells on CDK9. In order to explore synergy with the CDK9 inhibitor, proteolysis targeting chimeric molecule (PROTAC) ARV 825 was added. This latter drug causes ubiquitination of BET proteins resulting in their rapid and efficient degradation. Combination treatment of MM cells with ARV 825 and AZD 4573 markedly reduced their protein expression of BRD 2, BRD 4, MYC and phosphorylated RNA pol II as compared to each single agent alone. Combination treatment synergistically inhibited multiple myeloma cells both in vitro and in vivo with insignificant weight loss. The combination also resulted in marked increase of apoptotic cells at low dose compared to single agent alone. Taken together, our studies show for the first time that the combination of a BET PROTAC (ARV 825) plus AZD 4573 (CDK9 inhibitor) is effective against MM cells.### Competing Interest Statement

Background: Down syndrome acute lymphoblastic leukemia (DS‐ALL) is characterized by the high frequency of CRLF2‐rearrangements, JAK2-mutations, or RAS-pathway mutations. Intriguingly, JAK2 and RAS mutations are mutually exclusive in leukemic sub‐clones, causing dichotomy in therapeutic target choices. Results: Here we show that in primary leukemic cells from DS‐ALL, in the absence of RAS-mutations, wild-type (wt)RAS is active, and/or can be induced by the physiological ligand TSLP of the transmembrane-receptor CRLF2. We show active/inducible RAS in 14/20 (70%) of primary DS-ALL samples analyzed, 8 of which had no RAS-mutations, but 75% of those had either mutated or hyperphosphorylated JAK2. No wtRAS cases with mutated/hyperphosphorylated JAK2 were observed that lacked activated RAS protein. We prove in a cell model that elevated CRLF2 in combination with constitutionally active JAK2 is sufficient to activate wtRAS. We show that TSLP boosts the direct binding of active PTPN11 to wtRAS. Pre‐inhibition of RAS or PTPN11, but not of PI3K or JAK signaling, prevented TSLP‐induced RAS‐GTP boost. Using multivariate-clustering based on RAS‐activity/inducibility we show significant separation between standard‐risk and high‐risk DS‐ALL groups. Cox proportional-hazards model showed protein-activity (but not mutation status) as independently predictive of outcome. Conclusions: Our data indicate that RAS protein activity levels (and not JAK2/RAS mutation profiles), are predictive of outcome. Importantly, our data suggest that inhibition of RAS and direct RAS‐pathway components should be combined with PI3K/mTOR and/or JAK2 inhibitors for high-risk cases. Therapeutically this is relevant for >75% of DS‐ALL and our additional data suggest that it warrants further investigation in high-risk non‐DS-ALL.