Article16 September 2004free access MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II Yoontae Lee Yoontae Lee Institute of Molecular Biology and Genetics and School of Biological Science, Seoul National University, Seoul, Korea Search for more papers by this author Minju Kim Minju Kim Institute of Molecular Biology and Genetics and School of Biological Science, Seoul National University, Seoul, Korea Search for more papers by this author Jinju Han Jinju Han Institute of Molecular Biology and Genetics and School of Biological Science, Seoul National University, Seoul, Korea Search for more papers by this author Kyu-Hyun Yeom Kyu-Hyun Yeom Institute of Molecular Biology and Genetics and School of Biological Science, Seoul National University, Seoul, Korea Search for more papers by this author Sanghyuk Lee Sanghyuk Lee Division of Molecular Life Sciences, Ewha Womans University, Seoul, Korea Search for more papers by this author Sung Hee Baek Sung Hee Baek Institute of Molecular Biology and Genetics and School of Biological Science, Seoul National University, Seoul, Korea Search for more papers by this author V Narry Kim Corresponding Author V Narry Kim Institute of Molecular Biology and Genetics and School of Biological Science, Seoul National University, Seoul, Korea Search for more papers by this author Yoontae Lee Yoontae Lee Institute of Molecular Biology and Genetics and School of Biological Science, Seoul National University, Seoul, Korea Search for more papers by this author Minju Kim Minju Kim Institute of Molecular Biology and Genetics and School of Biological Science, Seoul National University, Seoul, Korea Search for more papers by this author Jinju Han Jinju Han Institute of Molecular Biology and Genetics and School of Biological Science, Seoul National University, Seoul, Korea Search for more papers by this author Kyu-Hyun Yeom Kyu-Hyun Yeom Institute of Molecular Biology and Genetics and School of Biological Science, Seoul National University, Seoul, Korea Search for more papers by this author Sanghyuk Lee Sanghyuk Lee Division of Molecular Life Sciences, Ewha Womans University, Seoul, Korea Search for more papers by this author Sung Hee Baek Sung Hee Baek Institute of Molecular Biology and Genetics and School of Biological Science, Seoul National University, Seoul, Korea Search for more papers by this author V Narry Kim Corresponding Author V Narry Kim Institute of Molecular Biology and Genetics and School of Biological Science, Seoul National University, Seoul, Korea Search for more papers by this author Author Information Yoontae Lee1, Minju Kim1, Jinju Han1, Kyu-Hyun Yeom1, Sanghyuk Lee2, Sung Hee Baek1 and V Narry Kim 1 1Institute of Molecular Biology and Genetics and School of Biological Science, Seoul National University, Seoul, Korea 2Division of Molecular Life Sciences, Ewha Womans University, Seoul, Korea *Corresponding author. Institute of Molecular Biology and Genetics and School of Biological Science, Seoul National University, Seoul 151-742, Korea. Tel.: +82 2 887 8734; Fax: +82 2 875 0907; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2004)23:4051-4060https://doi.org/10.1038/sj.emboj.7600385 PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info MicroRNAs (miRNAs) constitute a large family of noncoding RNAs that function as guide molecules in diverse gene silencing pathways. Current efforts are focused on the regulatory function of miRNAs, while little is known about how these unusual genes themselves are regulated. Here we present the first direct evidence that miRNA genes are transcribed by RNA polymerase II (pol II). The primary miRNA transcripts (pri-miRNAs) contain cap structures as well as poly(A) tails, which are the unique properties of class II gene transcripts. The treatment of human cells with α-amanitin decreased the level of pri-miRNAs at a concentration that selectively inhibits pol II activity. Furthermore, chromatin immunoprecipitation analyses show that pol II is physically associated with a miRNA promoter. We also describe, for the first time, the detailed structure of a miRNA gene by determining the promoter and the terminator of mir-23a∼27a∼24-2. These data indicate that pol II is the main, if not the only, RNA polymerase for miRNA gene transcription. Our study offers a basis for understanding the structure and regulation of miRNA genes. Introduction Hundreds of microRNA (miRNA) genes have been found in animals, plants, and viruses (Bartel, 2004; Murchison and Hannon, 2004; Pfeffer et al, 2004), making them one of the largest gene families miRNAs are defined as single-stranded RNAs ∼22 nt in length (ranging 19–25 nt) generated from endogenous transcripts that can form local hairpin structures in silico (Ambros et al, 2003). MiRNAs act as guide molecules, by base-pairing with the target mRNAs leading to translational repression and/or mRNA cleavage. Recent studies revealed the key roles of miRNAs in diverse regulatory pathways, including development timing control, hematopoietic cell differentiation, apoptosis, cell proliferation, and organ development (Bartel, 2004). MiRNAs and their targets seem to constitute remarkably complex regulatory networks since a single miRNA can bind to and regulate many different mRNA targets and, conversely, several different miRNAs can bind to and cooperatively control a single mRNA target (Lewis et al, 2003). To dissect these complex networks operated by miRNAs, it would be critical to understand how miRNA genes themselves are regulated. The majority of miRNA genes are located in intergenic regions or in antisense orientation to annotated genes (Lagos-Quintana et al, 2001; Lau et al, 2001; Lee and Ambros, 2001; Mourelatos et al, 2002), indicating that they form independent transcription units (Lee et al, 2002). Most of the other miRNA genes are found in intronic regions, which may be transcribed as part of the annotated genes. In animals, miRNAs are transcribed as long primary transcripts (pri-miRNAs), which are cropped into the hairpin-shaped pre-miRNAs by nuclear RNase III Drosha (Lee et al, 2003; Kim, 2004). This cleavage event is important because it predetermines mature miRNA sequence and generates optimal substrate for the subsequent events (Lee et al, 2003; Lund et al, 2004). The processing intermediate, pre-miRNA, is exported out of the nucleus by exportin-5 (Exp5), member of the Ran-dependent nuclear transport receptor family (Yi et al, 2003; Bohnsack et al, 2004; Lund et al, 2004). Pre-miRNA is subsequently cleaved by cytoplasmic RNase III Dicer (Bernstein et al, 2001; Grishok et al, 2001; Hutvagner et al, 2001; Ketting et al, 2001; Knight and Bass, 2001) into ∼22-nt miRNA duplex. One strand of this short-lived duplex is degraded by an unknown nuclease, while the other strand remains as a mature miRNA. Which strand to select is determined by the relative internal stability of the two ends of the duplex, that is, the strand with the less stable 5′ end (for instance, G:U pair versus G:C pair) usually survives (Khvorova et al, 2003; Schwarz et al, 2003). Our knowledge on miRNA biogenesis has been significantly advanced in recent years. However, little is known about transcription of miRNA genes although it is likely to be the key regulatory step in miRNA biogenesis. To understand the mechanism of miRNA gene regulation, the basic machinery for miRNA transcription needs first to be identified. RNA polymerase III (pol III) was initially believed to mediate miRNA transcription because it transcribes most small RNAs such as tRNAs and U6 snRNA. However, several circumstantial evidences suggest otherwise. Firstly, pri-miRNAs are sometimes over several kilobases long and contain stretches of more than four U's, which would have terminated transcription by pol III (Lee et al, 2002). In addition, a number of chimeric transcripts containing miRNA sequences and pieces of adjacent mRNAs have been found from EST analyses (Smalheiser, 2003). Many of these ESTs contain poly(A) tails and are occasionally spliced, suggesting that these transcripts are produced by RNA polymerase II (pol II), although it is not clear from this computational analysis whether these chimeric transcripts are indeed involved in miRNA biogenesis. Secondly, the expression profiles of miRNAs suggest the class II gene-like control over miRNA genes. Insertion of a pol II enhancer can induce miRNA in the case of bantem RNA in Drosophila (Brennecke et al, 2003). Temporal regulation of let-7 RNA in Caenorhabditis elegans is dependent on an enhancer element, termed temporal regulatory element (TRE) (Johnson et al, 2003). Thirdly, the analysis of the noncoding RNAs containing miRNA sequence (miR-155 (BIC) and miR-172 (EAT)) showed that they are polyadenylated and spliced (Tam, 2001; Aukerman and Sakai, 2003). The miR-172 precursor, EAT, in Arabidopsis was suggested to contain the cap structure because the RACE protocol used in the study favors capped RNAs (Aukerman and Sakai, 2003). However, direct experimental evidence is still missing as to (1) whether pol II is indeed responsible for miRNA gene transcription and (2) how miRNA genes are structured. Here we present the first direct evidence that miRNA genes are transcribed by pol II. Results In order to address these questions directly, we decided to analyze the 5′- and 3′-end structures of various pri-miRNAs. First, RNAs containing 7-methyl guanosine cap were selectively enriched from total RNA by affinity purification using eIF4E, the high-affinity cap-binding protein, fused to glutathione-S-transferase (GST) (Figure 1). As a control, hnRNP A1, which is a generic pre-mRNA-binding protein, was included (Burd and Dreyfuss, 1994). RNase protection assay (RPA) was carried out then to detect pri-miR-23a from the bound (B) and unbound (UB) fractions. The fragment of 69 nt representing pri-miR-23a was detected from the GST-eIF4E-bound fraction but not from the GST-hnRNP A1-bound fraction (Figure 1A). Pre-miR-23a and mature miR-23a was not retained in the eIF4E-bound fraction, indicating that only pri-miR-23a, but not its processed products, contains the cap structure. Figure 1.Pri-miRNAs contain the 5′ cap structures. (A) Affinity purification of cap-containing RNA followed by RPA. Total RNA from HeLa cells was used for selective enrichment using the cap-binding protein eIF4E. RNA was extracted from the bound (B) or unbound (UB) fraction. Because the whole RNA from each fraction was used for the assay without further normalization, it corresponds to 100% of the input. (B) RT–PCR demonstrating that cap is present not only in pri-miR-23a∼27a∼24-2 but also in pri-let-7a-1, pri-let-7a-3, pri-miR-30a, pri-miR-21, pri-miR-17∼18∼19a∼20∼19b-1, and pri-miR-15a∼16-1. GAPDH pre-mRNA, 45S pre-rRNA, and pre-tRNAtyr were used as controls. The whole RNA extracted from each fraction (100% of the bound (B) or 100% of the unbound (UB) fraction) was used for the assay. Download figure Download PowerPoint To test whether the 5′ cap is a general property of pri-miRNAs, we randomly chose seven different pri-miRNAs (miR-23a∼27a∼24-2, miR-30a, let-7a-1, let-7a-3, miR-21, miR-17∼18∼19a∼20∼19b-1, and miR-15a∼16-1) and analyzed them by RT–PCR (Figure 1B). Their genomic loci relative to the closest annotated genes are shown in Supplementary figure. Reverse transcription was carried out with gene-specific primers instead of oligo-dT primer. GAPDH pre-mRNA, 45S pre-rRNA, and pre-tRNAtyr were amplified as controls representing transcripts produced by RNA pol II, I, and III, respectively. All the pri-miRNAs tested in this study showed affinity to the GST-eIF4E column, indicating that they contain the cap structures. The affinities appear to vary, with pri-miR-15a∼16-1 being the lowest. Assuming that all the GAPDH pre-mRNA molecules are capped, approximately 5–50% of pri-miRNAs seem to contain the cap structures, which implicates that additional processing event(s) may exist prior to Drosha-mediated cropping step and removes the cap from the primary transcript. A similar approach was then taken to verify the presence of poly(A) tail at the 3′ end of pri-miRNA (Figure 2). Following selective enrichment of polyadenylated RNA using oligo-d(T) cellulose beads, RNA was extracted and analyzed by RPA (Figure 2A) and RT–PCR (Figure 2B). The results show that all of the pri-miRNAs tested in our study contain poly(A) tails although some of these signals may have come from internal priming at A stretches in the transcripts. Figure 2.Pri-miRNAs are polyadenylated. (A) Selective enrichment of polyadenylated RNA from HeLa total RNA using oligo-dT cellulose, followed by RPA. RNA was extracted from the bound (B) or unbound (UB) fraction. Because the whole RNA from these fractions was used for the assay without further normalization, it corresponds to 100% of the input. (B) RT–PCR showing that poly(A) tail is present not only in pri-miR-23a∼27a∼24-2 but also in pri-let-7a-1, pri-let-7a-3, pri-miR-30a, pri-miR-21, pri-miR-17∼18∼19a∼20∼19b-1, and pri-miR-15a∼16-1. GAPDH pre-mRNA, 45S pre-rRNA, and pre-tRNAtyr were used as controls. The whole RNA extracted from each fraction (100% of the bound (B) or 100% of the unbound (UB) fraction) was used for the assay. Download figure Download PowerPoint Next, we examined the sensitivity of miRNA transcription to α-amanitin, which is often used to distinguish among the activities of pol I, II, and III. Pol II is highly sensitive and therefore the treatment of mammalian cells in culture at a concentration of 50 μg/ml for 5–9 h results in the selective inhibition of RNA pol II (Figure 3). The levels of all tested pri-miRNAs were reduced (compare lanes 3 and 4), whereas those of pre-tRNAtyr and 45S rRNA precursor showed no change, indicating that miRNA transcription is carried out by pol II. The degrees of inhibition vary among different miRNAs, which may indicate the differential processing rates among pri-miRNAs. The RNAs with higher turnover rates will disappear more rapidly than others when transcription is blocked. The GAPDH pre-mRNA level was affected more than the levels of miRNAs, possibly due to the fact that pre-mRNA splicing takes place more rapidly than pri-miRNA processing. However, we do not exclude the possibility from these results that the effect of α-amanitin on pri-miRNA is indirect and that a minor fraction of pri-miRNAs can be transcribed by other RNA polymerase(s). Figure 3.Transcription of miRNA genes is sensitive to α-amanitin. HeLa cells were treated with α-amanitin at a concentration of either 0 or 50 μg/ml for 9 h. Total RNA was prepared from these cells and 5 μg of total RNA was subjected to cDNA synthesis in 20 μl reaction. The levels of pri-miRNAs were determined by RT–PCR using gene-specific primers. Different amounts (0.5, 1, or 2 μl) of cDNA template from the untreated cells (lanes 1–3) were used for PCR to see if the PCR amplification is in a quantitative range. GAPDH pre-mRNA, 45S pre-rRNA, and pre-tRNAtyr were used as controls. Download figure Download PowerPoint In order to gain further insights into miRNA transcription, we analyzed the gene structure of miR-23a∼27a∼24-2. Primer extension analysis was carried out to determine the transcription start site, using a primer that binds to the site between 13 and 42 bp downstream from the 3′ end of mature miR-23a (Figure 4A). Initial attempts failed due to the low steady-state level of pri-miR-23a∼27a∼24-2. This problem was circumvented by RNAi against Drosha, which otherwise rapidly cleaves pri-miRNA into smaller pre-miRNAs. Synthetic siRNA against Drosha mRNA was transfected to HeLa cells and total RNA was used for primer extension analysis. The major band of 123 nt and the minor band of 133 nt were detected from the Drosha-depleted cells (Figure 4B), indicating that transcription may start mainly at 59 bp upstream of the 5′ end of miR-23a. The fact that this band was detected only after Drosha depletion indicates that this extension product was derived from the authentic precursor of miRNA. Figure 4.The 5′-terminal structure of the miRNA gene cluster miR-23a∼27a∼24-2. (A) Sequences around the transcription start site of miR-23a∼27a∼24-2 gene. The sequences that bind to the primer used for primer extension (PE23B) are indicated. The filled arrow indicates the major transcription start site as determined by primer extension, while the empty arrow shows the minor start site. (B) Primer extension analysis to determine the transcription initiation site. The extension product was detectable only after the cell was treated with siRNA against Drosha (+siDrosha, lane 5). (C) Schematic diagram of the reporter construct. The segment ranging from −603 to +36 bp relative to the transcription initiation site was placed at the upstream of the luciferase gene (pGL3-23P639). (D) Relative activities of the firefly luciferase are presented after normalization against the cotransfected Renilla luciferase activity (internal control). pGL3-basic is the promoter-less construct used as the backbone to generate pGL3-23P639. (E) Primer extension analysis. The transcription initiation site from the reporter construct (pGL3-23P639) is identical to that from the endogenous miR-23a∼27a∼24-2 gene. Note that the primer (PXT-luc) used for extension is complimentary to the luciferase mRNA. Download figure Download PowerPoint To confirm that the site measured by primer extension is the transcription initiation site of the miR-23a∼27a∼24-2 gene, we constructed a reporter plasmid by inserting the region surrounding the extension termination site (between –603 and +36 bp) into pGL3-basic (Promega) that contains a promoter-less luciferase gene (Figure 4C). The resulting reporter plasmid, pGL3-23P639, was transfected into HEK293T cells along with Renilla luciferase expression vector, pRL-CMV, as an internal control. The luciferase activity from the reporter plasmid was elevated about 11-fold compared to that from the promoter-less pGL3-basic (Figure 4D). The transcription start site from pGL3-23P639 was determined by primer extension analysis using a primer that binds to the luciferase mRNA (PXT-luc; Figure 4C). If the transcription initiation site is identical to that from the endogenous miR-23a∼27a∼24-2 gene, primer extension is expected to result in a 124-nt product. Indeed, the primer was extended to 124 nt, demonstrating that the region covering –603 and +36 bp contains the genuine promoter of miR-23a∼27a∼24-2 (Figure 4E). However, we do not exclude the possibility of additional alternative promoter(s) further upstream of this promoter. The promoter region of miR-23a∼27a∼24-2 was further analyzed by constructing a series of reporter constructs containing different regions of the promoter (Figure 5). Expression levels of luciferase from the region covering −2010 to +36, −1519 to +36, −1014 to +36, and −806 to +36 bp were approximately five- to seven-fold higher compared to that from the promoter-less construct. Similar level of expression was observed with −403 to +36 and −203 to +36 bp, while gene expression from −603 to +36 bp was significantly higher than others, suggesting that there may be negative control element(s) between −806 and −603 bp. Positive control element(s) may be present between −603 and −403 bp and between −74 and −42 bp. Further deletion to −42 bp abolished the luciferase expression, indicating that this region between −74 and −42 bp contains critical element(s) required for transcriptional initiation. Figure 5.Analysis of the mir-23a∼27a∼24-2 gene promoter. (A) Schematic diagram of the reporter construct. The 5′ end (X) of the promoter varies from −2010 to +1, while the 3′ end corresponds to +36 relative to the transcription start site as determined in Figure 4. (B) Relative activities of luciferase expressed from the reporter constructs. The plasmids were cotransfected with Renilla luciferase construct into HEK293T cells and enzyme assay was carried out 48 h after transfection. Relative activities of the firefly luciferase are presented after normalization against the Renilla luciferase activity. Download figure Download PowerPoint To test if the promoter of miR-23a∼27a∼24-2 is recognized and used by RNA pol II, HEK293T cells were transfected with pGL3-23P639 and treated with α-amanitin at a concentration of 50 μg/ml for 6 h (Figure 6). Luciferase expression from the miR-23a∼27a∼24-2 promoter was strongly suppressed under this condition, confirming that the region covering –603 to +36 bp contains a promoter that is dependent on pol II. Figure 6.Transcription of mir-23a∼27a∼24-2 gene cluster is dependent on pol II. (A) Luciferase assay was performed using the reporter plasmid pGL3-23P639 or pRL-CMV. HEK293T cells were transfected with the reporter plasmids. Right after adding the plasmids, the cells were incubated in 0 or 50 μg/ml of α-amanitin for 6 h before the cells were harvested for assay. (B) RT–PCR to show that pol II activity (GAPDH pre-mRNA) is selectively reduced under this condition while pol III activity (pre-tRNAtyr) is not affected. Download figure Download PowerPoint Next, we examined the physical presence of pol II on this promoter by chromatin immunoprecipitation (ChIP) (Figure 7). Immunoprecipitation was performed with either IgG against pol II (anti-pol II; 8WG16), phosphorylated form of pol II (anti-pol II-P; H5), or normal mouse IgG. Phosphorylation of the C-terminal domain of the largest subunit of pol II triggers the polymerase to shift from initiation to elongation mode. In fact, unphosphorylated pol II binds much more tightly to the promoter region than does the phosphorylated form. The promoter region of miR-23a∼27a∼24-2 was precipitated with anti-pol II antibody but not with anti-phosphorylated pol II antibody or preimmune mouse IgG. Thus, this result demonstrates that transcription initiation by pol II occurs within this region. Figure 7.RNA pol II is physically associated with the promoter of mir-23a∼27a∼24-2 gene. (A) Sequences of the promoter region. The arrows indicate the primer sequences used for PCR. ‘+1’ represents the major transcription start site. (B) ChIP analyses of HeLa cell cultures are shown. ChIP analyses were performed with monoclonal antibody (anti-pol II; 8WG16) against the C-terminal domain of the largest RNAP II subunit RPB1 or monoclonal antibody against the phosphorylated form of RPB1 (anti-pol II-P; H5). Normal mouse serum (preimmune) was also used as a negative control. Chromatin immunoprecipitates were analyzed by PCR with primer pairs flanking the promoter regions of miR-23a∼27a∼24-2, 45S rRNA promoter, or tRNAtyr gene. PCR products were resolved by agarose gel electrophoresis, revealed by staining with ethidium bromide, and presented as the reverse images. Download figure Download PowerPoint A putative polyadenylation signal (AAUAAA) was found at +1752 bp downstream from the 3′ end of mature miR-24-2 (Figure 8A). From database searches, we could not find any ESTs containing miR-23a∼27a∼24-2 cluster itself. Interestingly, however, we found an mRNA (AL832183) and several ESTs (Unigene Hs.460763 and EC gene H19C3262.1) containing the sequences from right downstream of mature miR-24-2 (from +1 to +1771 relative to the 3′ end of miR-24-2). We hypothesized that these transcripts may have been derived from a longer primary transcript that is cleaved by Drosha. To test this possibility, we determined the actual cleavage site created by Drosha by directional cloning of pre-miR-24-2. Pre-miR-24-2 was prepared by in vitro processing and ligated to the 5′ and 3′ adapters as described previously (Lee et al, 2003). After cloning and sequencing of the ligated RNA, we found that Drosha cleaves at the 3′ end of miR-24-2 and generates exactly the same 5′ end as that of AL832183 (Figure 8B). This was confirmed by RT–PCR using three different reverse primers that bind to the sequences nearby the putative polyadenylation site (Figure 8A and C). The band of ∼2.2 kb was detected only when Drosha was depleted (Figure 8C). The intensity of PCR band was dramatically diminished, when the reverse primers (primers B and C) bind to the downstream sequences from the predicted polyadenylation site, confirming that the polyadenylation of pri-miR-23a∼27a∼24-2 occurs mainly at +1772 relative to the 3′ end of miR-24-2. Figure 8.The 3′-terminal structure of the miRNA gene cluster mir-23a∼27a∼24-2. (A) Schematic representation of pri-miR-23a∼27a∼24-2. A putative polyadenylation signal (AAUAAA) was found at +1751 bp downstream from the 3′ end of mature miR-24-2. From database searches, we found an mRNA (AL832183) containing the sequences from right downstream of mature miR-24-2 (from +1 to +1771 relative to the 3′ end of miR-24-2). (B) AL832183 appears to be the by-product of Drosha-mediated processing because Drosha cleaves at the 3′ end of miR-24-2 and generates exactly the same 5′ end as that of AL832183. The cleavage sites generated by Drosha are indicated by arrows. (C) RT–PCR using three different reverse primers that bind to the sequences nearby the putative polyadenylation site as indicated in (A). The band of ∼2.2 kb was clearly detected when reverse primer A was used (lane 1). Note that this signal can be seen only when Drosha was depleted by transfecting siRNA against Drosha (siDrosha) (lanes 1–3). Genomic DNA was used as the template in lanes 7–9 to qualify the PCR primer pairs. Download figure Download PowerPoint Discussion Our data demonstrate that miRNA genes are transcribed by pol II and they can be classified as class II genes along with all protein-coding genes and some of the noncoding genes such as U1, U2, U4, and U5 snRNA genes. Pol II-dependent transcription of miRNA genes may allow elaborate control of miRNA biogenesis during various regulatory pathways. The overall gene structure and transcription of miR-23a∼27a∼24-2 resemble that of protein-coding genes, except that the gene does not contain a long open reading frame. The short open reading frames found in this gene do not encode for any proteins that are homologous to known proteins. This raises a question concerning the role of the long flanking sequences in pri-miRNA and the fate of the processing products. Are they just simply ‘junk’ sequences? Most of the flanking sequences are actually dispensable for miRNA biogenesis itself while only about 25–100 nucleotides surrounding both the ends of the stem–loops are required for pri-miRNA processing (Zeng et al, 2002; Lee et al, 2003; Chen et al, 2004). Chimeric ESTs containing both miRNA and mRNA sequences have been previously found (Smalheiser, 2003). Some of these chimeric ESTs possess long open reading frames that may code for proteins. It is not clear, however, if any of these proteins are actually expressed from these transcripts. It remains to be seen if a single primary transcript can be used to generate both miRNA and protein. A related question to this is if there is any fundamental difference between pri-miRNAs and protein-coding pre-mRNAs. Also important is if miRNA pathway and mRNA (protein synthesis) pathway affect each other, which may provide a new way of gene regulation. Extensive analyses on miRNA gene structure and processing will be necessary to fully answer these questions. Our results suggest that a considerable amount of a given pri-miRNA does not contain 5′ cap or poly(A) tail. This can be interpreted such that RNA polymerase(s) other than pol II may be partly involved in transcription. Alternatively, the primary transcripts are processed in a way that the original 5′- and 3′-end structures are lost during the process. For intronic miRNAs such as miR-15a∼16-1, splicing may separate the 5′ cap and the poly(A) tail from the miRNA sequence. For others, it would be interesting to ask if there is any unidentified processing event(s) prior to Drosha-mediated cleavage. The promoter of miR-23a∼27a∼24-2 gene determined in this study seems to lack the known common promoter elements that are required for transcription initiation complex, including the TATA box, the initiator element, the downstream promoter element (DPE), or the TFIIB recognition element (BRE) (Smale and Kadonaga, 2003). Less common promoter elements such as the downstream core element (DCE), the DPE found in the human glial fibrillary acidic protein, and the MED-1 (multiple start site element downstream) are also missing in this promoter (Smale and Kadonaga, 2003). The miR-23a∼27a∼24-2 promoter is not similar to the promoters of RNA pol II-transcribed U snRNA genes because we could not find the proximal sequence element (PSE) that is highly conserved in U snRNA genes. Possibly, the only exception may be the GC boxes. Relatively GC-rich region can be found between −530 and −410 bp, which contains at least two GC box consensus sequences. These may be functional GC boxes because the deletion of this region (−603 through −404 bp) resulted in a moderate (∼2-fold) but reproducible reduction in luciferase expression (Figure 5B). Further analysis on the promoters of various miRNA genes would be necessary to draw a general conclusion about miRNA promoters and to fully understand the mechanism of transcriptional initiation of miRNA genes. The information on miRNA-specific element(s) would be invaluable for the prediction of miRNA genes in genomic context and for dissecting the miRNA-operated regulatory networks. Materials and methods RT–PCR analysis The first-strand cDNA synthesis was carried out using SUPERSCRIPT II (Invitrogen) and the

SARS-CoV-2 is a betacoronavirus responsible for the COVID-19 pandemic. Although the SARS-CoV-2 genome was reported recently, its transcriptomic architecture is unknown. Utilizing two complementary sequencing techniques, we present a high-resolution map of the SARS-CoV-2 transcriptome and epitranscriptome. DNA nanoball sequencing shows that the transcriptome is highly complex owing to numerous discontinuous transcription events. In addition to the canonical genomic and 9 subgenomic RNAs, SARS-CoV-2 produces transcripts encoding unknown ORFs with fusion, deletion, and/or frameshift. Using nanopore direct RNA sequencing, we further find at least 41 RNA modification sites on viral transcripts, with the most frequent motif, AAGAA. Modified RNAs have shorter poly(A) tails than unmodified RNAs, suggesting a link between the modification and the 3' tail. Functional investigation of the unknown transcripts and RNA modifications discovered in this study will open new directions to our understanding of the life cycle and pathogenicity of SARS-CoV-2.

Summary

 The Drosha-DGCR8 complex initiates microRNA maturation by precise cleavage of the stem loops that are embedded in primary transcripts (pri-miRNAs). Here we propose a model for this process that is based upon evidence from both computational and biochemical analyses. A typical metazoan pri-miRNA consists of a stem of ∼33 bp, with a terminal loop and flanking segments. The terminal loop is unessential, whereas the flanking ssRNA segments are critical for processing. The cleavage site is determined mainly by the distance (∼11 bp) from the stem-ssRNA junction. Purified DGCR8, but not Drosha, interacts with pri-miRNAs both directly and specifically, and the flanking ssRNA segments are vital for this binding to occur. Thus, DGCR8 may function as the molecular anchor that measures the distance from the dsRNA-ssRNA junction. Our current study thus facilitates the prediction of novel microRNAs and will assist in the rational design of small hairpin RNAs for RNA interference.

The precise control of microRNA (miRNA) biogenesis is critical for embryonic development and normal cellular functions, and its dysregulation is often associated with human diseases. Though the birth and maturation pathway of miRNA has been established, the regulation and death pathway remains largely unknown. Here, we report the RNA-binding proteins, Lin28a and Lin28b, as posttranscriptional repressors of let-7 miRNA biogenesis. We observe that the Lin28 proteins act mainly in the cytoplasm by inducing uridylation of precursor let-7 (pre-let-7) at its 3′ end. The uridylated pre-let-7 (up-let-7) fails Dicer processing and undergoes degradation. We provide a mechanism for the posttranscriptional regulation of miRNA biogenesis by Lin28 which is highly expressed in undifferentiated cells and certain cancer cells. The Lin28-mediated downregulation of let-7 may play a key role in development, stem cell programming, and tumorigenesis.

As key regulators in cellular functions, microRNAs (miRNAs) themselves need to be tightly controlled. Lin28, a pluripotency factor, was reported to downregulate let-7 miRNA by inducing uridylation of let-7 precursor (pre-let-7). But the enzyme responsible for the uridylation remained unknown. Here we identify a noncanonical poly (A) polymerase, TUTase4 (TUT4), as the uridylyl transferase for pre-let-7. Lin28 recruits TUT4 to pre-let-7 by recognizing a tetra-nucleotide sequence motif (GGAG) in the terminal loop. TUT4 in turn adds an oligouridine tail to the pre-let-7, which blocks Dicer processing. Other miRNAs with the same sequence motif (miR-107, -143, and -200c) are regulated through the same mechanism. Knockdown of TUT4 and Lin28 reduces the level of stem cell markers, suggesting that they are required for stem cell maintenance. This study uncovers the role of TUT4 and Lin28 as specific suppressors of miRNA biogenesis, which has implications for stem cell research and cancer biology.

A hallmark of RNA silencing is a class of approximately 22-nucleotide RNAs that are processed from double-stranded RNA precursors by Dicer. Accurate processing by Dicer is crucial for the functionality of microRNAs (miRNAs). The current model posits that Dicer selects cleavage sites by measuring a set distance from the 3′ overhang of the double-stranded RNA terminus. Here we report that human Dicer anchors not only the 3′ end but also the 5′ end, with the cleavage site determined mainly by the distance (∼22 nucleotides) from the 5′ end (5′ counting rule). This cleavage requires a 5′-terminal phosphate group. Further, we identify a novel basic motif (5′ pocket) in human Dicer that recognizes the 5′-phosphorylated end. The 5′ counting rule and the 5′ anchoring residues are conserved in Drosophila Dicer-1, but not in Giardia Dicer. Mutations in the 5′ pocket reduce processing efficiency and alter cleavage sites in vitro. Consistently, miRNA biogenesis is perturbed in vivo when Dicer-null embryonic stem cells are replenished with the 5′-pocket mutant. Thus, 5′-end recognition by Dicer is important for precise and effective biogenesis of miRNAs. Insights from this study should also afford practical benefits to the design of small hairpin RNAs. The microRNAs (miRNAs) prominently involved in gene silencing in plants and animals are typically about 22 nucleotides long. They are produced by sequential cleavage of a longer precursor by two ribonucleases, one of which is Dicer. It was thought that Dicer uses a 'ruler' mechanism, measuring the length from the 3′ end of the double-stranded RNA to make the cleavage that releases the functional 22-nucleotide RNA. Here, V. Narry Kim and colleagues show that Dicer contains a pocket to bind the precursor's phosphorylated 5′ end, and that cleavage is in fact measured by counting the distance from this end. Mutation of the 5′ pocket in Dicer affects miRNA processing in vivo, indicating the importance of this counting mechanism.

microRNAs (miRNAs) play integral roles in diverse processes including tumorigenesis. miRNA gene loci are often found in close conjunction, and such clustered miRNA genes are transcribed from a common promoter to generate polycistronic primary transcript. The primary transcript (pri-miRNA) is then processed by two RNase III proteins to release the mature miRNAs. Although it has been speculated that the miRNAs in the same cluster may play related biological functions, this has not been experimentally addressed. Here we report that the miRNAs in two clusters (miR-106b approximately 93 approximately 25 and miR-222 approximately 221) suppress the Cip/Kip family members of Cdk inhibitors (p57(Kip2), p21(Cip1) and p27(Kip1)). We show that miR-25 targets p57 through the 3'-UTR. Furthermore, miR-106b and miR-93 control p21 while miR-222 and miR-221 regulate both p27 and p57. Ectopic expression of these miRNAs results in activation of Cdk2 and facilitation of G1/S phase transition. Consistent with these results, both clusters are abnormally upregulated in gastric cancer tissues compared to the corresponding normal tissues. Ectopic expression of miR-222 cluster enhanced tumor growth in the mouse xenograft model. Our study demonstrates the functional associations between clustered miRNAs and further implicates that effective cancer treatment may require a combinatorial approach to target multiple oncogenic miRNA clusters.

Summary

 The Drosha-DGCR8 complex, also known as Microprocessor, is essential for microRNA (miRNA) maturation. Drosha functions as the catalytic subunit, while DGCR8 (also known as Pasha) recognizes the RNA substrate. Although the action mechanism of this complex has been intensively studied, it remains unclear how Drosha and DGCR8 are regulated and if these proteins have any additional role(s) apart from miRNA processing. Here, we report that Drosha and DGCR8 regulate each other posttranscriptionally. The Drosha-DGCR8 complex cleaves the hairpin structures embedded in the DGCR8 mRNA and thereby destabilizes the mRNA. We further find that DGCR8 stabilizes the Drosha protein via protein-protein interaction. This crossregulation between Drosha and DGCR8 may contribute to the homeostatic control of miRNA biogenesis. Furthermore, microarray analyses suggest that a number of mRNAs may be downregulated in a Microprocessor-dependent, miRNA-independent manner. Our study reveals a previously unsuspected function of Microprocessor in mRNA stability control.