In 2006, an outbreak of chikungunya fever — an arthralgic disease caused by a mosquito-borne alphavirus — swept over a number of islands in the Indian Ocean (the Comoros, Mauritius, the Seychelles, Madagascar, Mayotte, and Reunion). In Reunion, which has a population of 770,000, there were 265,000 clinical cases (an incidence of 34%), and the disease was implicated in 237 deaths (about 1 per 1000 clinical cases); a recent report by Reunion health authorities indicated that the seroprevalence was 35%, with very few asymptomatic cases. The epidemic had started with outbreaks in Kenya in 2004 and the Comoros early in . . .

Abstract Background Toscana virus (TOSV) is a sandfly-borne phlebovirus causing central nervous system (CNS) infection in Mediterranean countries, during summer season. However, clinical aspects of the disease caused by this virus are poorly known by clinicians, so that its prevalence is probably underestimated due to a lack of diagnosis. Study design We gathered data from all available case series and retrospective studies identifying TOSV as the causative viral agent. The informations of age, sex, clinical characteristics, laboratory findings, imaging results and clinical outcomes of TOSV infection were recorded and analyzed. Results In our review a total of 95 articles including TOSV infections resulting in a total of 1,381 cases were analyzed. Our findings indicate, TOSV affects individuals across various age groups, with a median age of 44.45 years. A notable disparity in infection rates between genders, with men being significantly more likely to present symptoms due to TOSV than women, with a sex ratio of 2.0 (p<0.001). The clinical presentation of TOSV infection encompasses a range of symptoms, including fever, headache, retro-orbital pain, neurological and muscular manifestations with less common reports of cutaneous and gastrointestinal symptoms. To date, six fatalities have been attributed to TOSV infections, with a median age of 76 years. Diagnostic evaluation of TOSV infections often involves the analysis of cerebrospinal fluid, where findings may include an elevated white blood cell count. Conclusions These findings underscore the diverse clinical manifestations of TOSV infections and highlight the importance of considering this pathogen in the differential diagnosis of patients presenting with acute febrile illness, especially in endemic regions. TOSV represents an emerging infectious threat that warrants inclusion in the diagnostic protocols for patients presenting with CNS, particularly within the Mediterranean basin or for those with recent travel history to endemic regions during warmer months when sandflies are actively circulating.

Abstract Many enteric viruses are found in pig farms around the world and can cause death of animals or important production losses for breeders. Among the wide spectrum of enteric viral species, porcine Sapelovirus (PSV), porcine Kobuvirus (PKoV) and porcine Astrovirus (PAstV) are frequently found in pig feces. In this study we investigated sixteen pig farms in Corsica, France, to evaluate the circulation of three enteric viruses (PKoV, PAstV-1 and PSV). In addition to the three viruses studied by RT–qPCR (908 pig feces samples), 26 stool samples were tested using the Next Generation Sequencing method (NGS). Our results showed viral RNA detection rates (i) of 62.0% [58.7–65.1] (n = 563/908) for PSV, (ii) of 44.8% [41.5–48.1] (n = 407/908) for PKoV and (iii) of 8.6% [6.8–10.6] (n = 78/908) for PAstV-1. Significant differences were observed for all three viruses according to age (P-value = 2.4e–13 for PAstV-1; 2.4e–12 for PKoV and 0.005 for PSV). The type of breeding was significantly associated with RNA detection only for PAstV-1 (P-value = 9.6e–6). Among the 26 samples tested with NGS method, consensus sequences corresponding to 10 different species of virus were obtained This study provides first insight on the presence of three common porcine enteric viruses in France. We also showed that they are frequently encountered in pigs born and bred in Corsica, which demonstrates endemic local circulation. Importance This study provides important information in the comprehension of the epidemiology of different viruses circulating in swine farms. We have shown the great diversity of viruses that could be present in extensive farms. Moreover, to our knowledge, this is the first detection of these different viruses in France. So far, this study has to be considered as a first step in the study of enteric viruses in Corsican pig farms.

Clinical samples collected in COVID-19 patients are commonly manipulated in BSL-2 laboratories for diagnostic purpose. We used the French norm NF-EN-14476+A2 derived from the European standard EN-14885. To avoid the risk of exposure of laboratory workers, we showed that Triton-X100 must be added to guanidinium thiocyanate-lysis buffers to obtain a 6-log reduction of infectious virus. Although heating protocol consisting of 92C-15min was more effective rather than 56C-30min and 60C-60min to achieve 6-log reduction, it is not amenable for molecular detection on respiratory specimens because of important decrease of detectable RNA copies in the treated sample vs untreated sample. The 56C-30min and 60C-60min should be used for inactivation of serum / plasma samples for serology because of the 5log10 reduction of infectivity and low viral loads in blood specimens.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

Abstract Toscana virus (TOSV) is a leading cause of summer viral meningitis in central Italy and south of France, and can cause severe neurological cases. Within the Mediterranean basin, it is transmitted by hematophagous sand flies belonging to the Phlebotomus genus. Despite the identification of the primary TOSV vectors, the virus’s developmental cycle in vector species remains largely unknown. Limited research has been conducted on transmission dynamics and the vectorial competence and capacity of the principal TOSV vector, Phlebotomus perniciosus . In this context, we investigated the intra-vector TOSV infection dynamics in Ph. perniciosus , as well as its impact on the vector’s life history traits. Female sand flies were experimentally infected with TOSV though an artificial blood meal. Systemic dissemination of the virus was observed approximately three days post-infection, potentially resulting in a shorter extrinsic incubation period. Moreover, the study revealed a longer hatching time for eggs laid by infected females. This research not only confirmed the vector competence of Ph. perniciosus but also provided the first insight into TOSV’s developmental cycle and its impact on the vector. These findings prompt further exploration of TOSV transmission dynamics, raise new hypotheses on the virus transmission and highlight the importance of follow-up studies. Author summary Toscana virus (TOSV) is a reemerging sandfly-borne virus causing neuroinvasive infections in humans. This virus is endemic in the Mediterranean basin, with a potential risk of introduction in northern Europe and Asia. Despite decades of research, few studies have focused on the development cycle of TOSV in sand flies and the dynamics of transmission. Here, we provide a comprehensive study of the intra-vector dynamics of TOSV infection and its impact on both vector biology and transmission. Through experimental infections of the major vector Phlebotomus perniciosus , we not only confirmed vector competence but also provided the first insight into the TOSV developmental cycle in the vector by estimating the extrinsic incubation period at six days. Our study reveals an impact of TOSV infection on vector hatching time leading to a delayed emergence of infected sand flies, with a potential impact on transmission. Our findings encourage further exploration of transmission dynamics, raise new hypotheses on alternative transmission pathways, and emphasize the importance of follow-up studies.

Abstract Background West Nile (WNV) and Usutu (USUV) virus are vector-borne flaviviruses causing neuroinvasive infections in both humans and animals. Entomological surveillance is a method of choice for identifying virus circulation ahead of the first human and animal cases, but performing molecular screening of vectors is expensive, and time-consuming. Methods We implemented the MX (Molecular Xenomonitoring) strategy for the detection of WNV and USUV circulation in mosquito populations in rural and urban areas in Nouvelle-Aquitaine region (France) between July and August 2023, using modified BG Sentinel traps. We first performed molecular screening and sequencing on excreta from trapped mosquitoes before confirming the results by detecting, sequencing and isolating viruses from individual mosquitoes. Findings We identified WNV and USUV-infected mosquitoes in 3 different areas, concurrently with the first human cases reported in the region. Trapped mosquito excreta revealed substantial virus co-circulation (75% of traps had PCR+ excreta for at least one of both viruses). Cx. pipiens was the most common species infected by both WNV and USUV. Genomic data from excreta and mosquitoes showed the circulation of WNV lineage 2 and USUV lineage Africa 3, both phylogenetically close to strains that circulated in Europe in recent years. Four WNV and 3 USUV strains were isolated from trapped mosquitoes. Interpretation MX strategy is easy and rapid to implement on the field, and has proven its effectiveness in detecting WNV and USUV circulation in local mosquito populations. Funding This study received funding from the Direction Générale de l’Armement (PDH 2 NBC-5-B-2212) and ARBOGEN (funded by MSDAVENIR). Research in context Evidence before this study WNV and USUV circulate through complex transmission cycles involving mosquitoes as vectors, birds as amplifying hosts and several mammal species as dead-end hosts. Transmission to humans primarily occurs through mosquito bites for both viruses. Notably, WNV can also be transmitted through blood donations and organ transplants. It is estimated that a significant proportion of both WNV and USUV infections in vertebrate hosts remain unreported due to their predominantly asymptomatic nature or nonspecific clinical presentation. Nevertheless, neuroinvasive and potentially fatal disease can occur, in particular among vulnerable populations such as elderly and immunocompromised patients. In France, after its first detection in 2015, USUV has been sporadically found in eastern and southern departments, with confirmed infections in birds, mosquitoes and mammals, and few human cases described. WNV has recently caused annual outbreaks of varying intensities involving humans, equids and avifauna in French departments mainly located in the Mediterranean area. Because of low viral loads and/or brief viremia, diagnosis of both pathogens is often based on serological evidence, and few genomic data are available on strains having circulated in France. Entomological surveillance can be used as an early warning method for WNV and USUV surveillance, but is costly to implement as it requires the collection of large numbers of mosquitoes to detect virus circulation when infection rates in mosquito populations are low. Therefore, viral surveillance in France still heavily relies on human and animal surveillance, i.e. late indicators of viral circulation. Added value of this study This study describes the implementation of the MX (Molecular Xenomonitoring) strategy for the effective surveillance of WNV and USUV circulation within mosquito populations. MX uses of modified BG Sentinels that allow (i) trapped mosquitoes to survive for several days and (ii) corresponding mosquito excreta to be collected and preserved on filter paper. MX has demonstrated many advantages over traditional entomological surveillance. Firstly, screening excreta collectively deposited by a community of trapped mosquitoes for the presence of viruses in the first instance is time and cost efficient, as one sample is tested for viral RNA, regardless of the number and species diversity in the trap. Second, filter papers with mosquito excreta can be transported from the field to the laboratory at room temperature by regular postal mail, bringing real-time detection within reach. WNV and USUV RNA have been detected and sequenced directly from the mosquito excreta shortly after collection. Thirdly, MX adapters increase the longevity of trapped mosquitoes, thereby allowing extension of the time between trap collections and increasing the likelihood of virus shedding by infected mosquitoes. Fourthly, this approach is easy to implement in the field and requires neither a strong entomological background nor specific technical skills. All these aspects make the MX strategy a powerful, non-invasive and cost-effective tool for real-time monitoring of enzootic WNV and USUV circulation. Authors should describe here how their findings add value to the existing evidence. WNV was never detected on the Atlantic seaboard of France until October 2022. Molecular evidence of WNV circulation was obtained in 3 symptomatic horses in the Nouvelle Aquitaine region in October 2022, concomitantly with an USUV human case with no recent travel history outside the region. This was a harbinger of an increase in cases over the next year. In 2023, MX succeeded in detecting the enzootic co-circulation of WNV and USUV in rural and urban areas of Nouvelle Aquitaine, simultaneously with the first cases of WNV detected by human and animal surveillance and the first human case of USUV diagnosed in the end of July 2023. Genomic and phylogenetic information was obtained directly from trapped mosquito excreta, before information derived from animal or human surveillance. Mosquitoes from traps with PCR-positive excreta were analysed individually, which allowed to calculate infection rates in mosquitoes. WNV and USUV were isolated from single Cx. pipiens mosquitoes. Cx. pipiens was the species most commonly found positive for either viruses although WNV was also detected in Ochlerotatus and Aedes mosquitoes, including one tiger mosquito ( Ae. albopictus ) in the urban environment. We argue that the MX approach is a major asset in the early warning detection of WNV and USUV circulation to alert health policy makers and take suitable control measures.

For handling safely infectious agents, European laboratories must comply with specific EC Directives, national regulations and recommendations from the World Health Organization (WHO). To prevent laboratory acquired infections (LAIs) and pathogens dissemination, a key biosafety rule requires that any infectious material (clinical specimens or research samples) manipulated outside a biosafety cabinet (BSC) must be inactivated unless the lack of infectivity is proven. This inactivation process is a crucial step for biosafety and must be guided by a rigorous experimental qualification and validation procedure. However, for diagnostic or research laboratories, this process is not harmonized with common standard operation procedures (SOPs) but based on individual risk assessment and general international guidelines which can pose problems in emergency situations such as major outbreaks or pandemics. This review focuses on viral inactivation method, outlining the current regulatory framework, its limitations and a number of ways in which biosafety can be improved.