Abstract RNA velocity has been rapidly adopted to guide the interpretation of transcriptional dynamics in snapshot single-cell transcriptomics data. Current approaches for estimating and analyzing RNA velocity can empirically reveal complex dynamics but lack effective strategies for quantifying the uncertainty of the estimate and its overall applicability to the system of interest. Here, we present veloVI (velocity variational inference), a deep generative modeling framework for estimating RNA velocity. veloVI learns a gene-specific dynamical model of RNA metabolism and provides a transcriptome-wide quantification of velocity uncertainty. We show in a series of examples that veloVI compares favorably to previous approaches for inferring RNA velocity with improvements in fit to the data, consistency across transcriptionally similar cells, and stability across preprocessing pipelines for quantifying RNA abundance. Further, we demonstrate that properties unique to veloVI, such as posterior velocity uncertainty, can be used to assess the appropriateness of analysis with velocity to the data at hand. Finally, we highlight veloVI as a flexible framework for modeling transcriptional dynamics by adapting the underlying dynamical model to use time-dependent transcription rates.

A bstract The paired measurement of RNA and surface protein abundance in single cells with CITE-seq is a promising approach to connect transcriptional variation with cell phenotypes and functions. However, each data modality exhibits unique technical biases, making it challenging to conduct a joint analysis and combine these two views into a unified representation of cell state. Here we present Total Variational Inference (totalVI), a framework for the joint probabilistic analysis of paired RNA and protein data from single cells. totalVI probabilistically represents the data as a composite of biological and technical factors such as limited sensitivity of the RNA data, background in the protein data, and batch effects. To evaluate totalVI, we performed CITE-seq on immune cells from murine spleen and lymph nodes with biological replicates and with different antibody panels measuring over 100 surface proteins. With this dataset, we demonstrate that totalVI provides a cohesive solution for common analysis tasks like the integration of datasets with matched or unmatched protein panels, dimensionality reduction, clustering, evaluation of correlations between molecules, and differential expression testing. totalVI enables scalable, end-to-end analysis of paired RNA and protein data from single cells and is available as open-source software.

A bstract Single-cell ATAC sequencing (scATAC-seq) is a powerful and increasingly popular technique to explore the regulatory landscape of heterogeneous cellular populations. However, the high noise levels, degree of sparsity, and scale of the generated data make its analysis challenging. Here we present PeakVI, a probabilistic framework that leverages deep neural networks to analyze scATAC-seq data. PeakVI fits an informative latent space that preserves biological heterogeneity while correcting batch effects and accounting for technical effects such as library size and region-specific biases. Additionally, PeakVI provides a technique for identifying differential accessibility at a single region resolution, which can be used for cell-type annotation as well as identification of key cis-regulatory elements. We use public datasets to demonstrate that PeakVI is scalable, stable, robust to low-quality data, and outperforms current analysis methods on a range of critical analysis tasks. PeakVI is publicly available and implemented in the scvi-tools framework: https://docs.scvi-tools.org/ .

Detecting differentially expressed genes is important for characterizing subpopulations of cells. However, in scRNA-seq data, nuisance variation due to technical factors like sequencing depth and RNA capture efficiency obscures the underlying biological signal. First, we show that deep generative models, which combined Bayesian statistics and deep neural networks, better estimate the log-fold-change in gene expression levels between subpopulations of cells. Second, we use Bayesian decision theory to detect differentially expressed genes while controlling the false discovery rate. Our experiments on simulated and real datasets show that our approach outperforms state-of-the-art DE frameworks. Finally, we introduce a technique for improving the posterior approximation, and show that it also improves differential expression performance.

In single-cell RNA sequencing data, biological processes or technical factors may induce an overabundance of zero measurements. Existing probabilistic approaches to interpreting these data either model all genes as zero-inflated, or none. But the overabundance of zeros might be gene-specific. Hence, we propose the AutoZI model, which, for each gene, places a spike-and-slab prior on a mixture assignment between a negative binomial (NB) component and a zero-inflated negative binomial (ZINB) component. We approximate the posterior distribution under this model using variational inference, and employ Bayesian decision theory to decide whether each gene is zero-inflated. On simulated data, AutoZI outperforms the alternatives. On negative control data, AutoZI retrieves predictions consistent to a previous study on ERCC spike-ins and recovers similar results on control RNAs. Applied to several datasets and instances of the 10x Chromium protocol, AutoZI allows both biological and technical interpretations of zero-inflation. Finally, AutoZI’s decisions on mouse embyronic stem-cells suggest that zero-inflation might be due to transcriptional bursting.

Recent studies using single cell RNA-seq (scRNA-seq) data derived from differentiating systems have raised fundamental questions regarding the discrete vs continuous nature of both differentiation and cell fate. Here we present Palantir, an algorithm that models trajectories of differentiating cells, which treats cell-fate as a probabilistic process, and leverages entropy to measure the changing nature of cell plasticity along the differentiation trajectory. Palantir generates a high resolution pseudotime ordering of cells, and assigns each cell state with its probability to differentiate into each terminal state. We apply Palantir to human bone marrow scRNA-seq data and detect key landmarks of hematopoietic differentiation. Palantir's resolution enables identification of key transcription factors driving lineage fate choices, as these TFs closely track when cells lose plasticity. We demonstrate that Palantir is generalizable to diverse tissue types and well-suited to resolve less studied differentiating systems.

Cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing (CITE-seq) combines unbiased single-cell transcriptome measurements with surface protein quantification comparable to flow cytometry, the gold standard for cell type identification. However, current analysis pipelines cannot address the two primary challenges of CITE-seq data: combining both modalities in a shared latent space that harnesses the power of the paired measurements, and handling the technical artifacts of the protein measurement, which is obscured by non-negligible background noise. Here we present Total Variational Inference (totalVI), a fully probabilistic end-to-end framework for normalizing and analyzing CITE-seq data, based on a hierarchical Bayesian model. In totalVI, the mRNA and protein measurements for each cell are generated from a low-dimensional latent random variable unique to that cell, representing its cellular state. totalVI uses deep neural networks to specify conditional distributions. By leveraging advances in stochastic variational inference, it scales easily to millions of cells. Explicit modeling of nuisance factors enables totalVI to produce denoised data in both domains, as well as a batch-corrected latent representation of cells for downstream analysis tasks.

A bstract Probabilistic models have provided the underpinnings for state-of-the-art performance in many single-cell omics data analysis tasks, including dimensionality reduction, clustering, differential expression, annotation, removal of unwanted variation, and integration across modalities. Many of the models being deployed are amenable to scalable stochastic inference techniques, and accordingly they are able to process single-cell datasets of realistic and growing sizes. However, the community-wide adoption of probabilistic approaches is hindered by a fractured software ecosystem resulting in an array of packages with distinct, and often complex interfaces. To address this issue, we developed scvi-tools ( https://scvi-tools.org ), a Python package that implements a variety of leading probabilistic methods. These methods, which cover many fundamental analysis tasks, are accessible through a standardized, easy-to-use interface with direct links to Scanpy, Seurat, and Bioconductor workflows. By standardizing the implementations, we were able to develop and reuse novel functionalities across different models, such as support for complex study designs through nonlinear removal of unwanted variation due to multiple covariates and reference-query integration via scArches. The extensible software building blocks that underlie scvi-tools also enable a developer environment in which new probabilistic models for single cell omics can be efficiently developed, benchmarked, and deployed. We demonstrate this through a code-efficient reimplementation of Stereoscope for deconvolution of spatial transcriptomics profiles. By catering to both the end user and developer audiences, we expect scvi-tools to become an essential software dependency and serve to formulate a community standard for probabilistic modeling of single cell omics.

A bstract Detecting differentially expressed genes is important for characterizing subpopulations of cells. In scRNA-seq data, however, nuisance variation due to technical factors like sequencing depth and RNA capture efficiency obscures the underlying biological signal. Deep generative models have been extensively applied to scRNA-seq data, with a special focus on embedding cells into a low-dimensional latent space and correcting for batch effects. However, little attention has been given to the problem of utilizing the uncertainty from the deep generative model for differential expression. Furthermore, the existing approaches do not allow controlling for the effect size or the false discovery rate. Here, we present lvm-DE, a generic Bayesian approach for performing differential expression from using a fitted deep generative model, while controlling the false discovery rate. We apply the lvm-DE framework to scVI and scSphere, two deep generative models. The resulting approaches outperform the state-of-the-art methods at estimating the log fold change in gene expression levels, as well as detecting differentially expressed genes between subpopulations of cells.

Abstract Contemporary single-cell omics technologies have enabled complex experimental designs incorporating hundreds of samples accompanied by detailed information on sample-level conditions. Current approaches for analyzing condition-level heterogeneity in these experiments often rely on a simplification of the data such as an aggregation at the cell-type or cell-state-neighborhood level. Here we present MrVI, a deep generative model that provides sample-sample comparisons at a single-cell resolution, permitting the discovery of subtle sample-specific effects across cell populations. Additionally, the output of MrVI can be used to quantify the association between sample-level metadata and cell state variation. We benchmarked MrVI against conventional meta-analysis procedures on two synthetic datasets and one real dataset with a well-controlled experimental structure. This work introduces a novel approach to understanding sample-level heterogeneity while leveraging the full resolution of single-cell sequencing data.