Abstract Stimulated CD4+ T lymphocytes can differentiate into effector T cell (Teff) or inducible regulatory T cell (Treg) subsets with specific immunological roles. We show that Teff and Treg require distinct metabolic programs to support these functions. Th1, Th2, and Th17 cells expressed high surface levels of the glucose transporter Glut1 and were highly glycolytic. Treg, in contrast, expressed low levels of Glut1 and had high lipid oxidation rates. Consistent with glycolysis and lipid oxidation promoting Teff and Treg, respectively, Teff were selectively increased in Glut1 transgenic mice and reliant on glucose metabolism, whereas Treg had activated AMP-activated protein kinase and were dependent on lipid oxidation. Importantly, AMP-activated protein kinase stimulation was sufficient to decrease Glut1 and increase Treg generation in an asthma model. These data demonstrate that CD4+ T cell subsets require distinct metabolic programs that can be manipulated in vivo to control Treg and Teff development in inflammatory diseases.

Activated T cells engage aerobic glycolysis and anabolic metabolism for growth, proliferation, and effector functions. We propose that a glucose-poor tumor microenvironment limits aerobic glycolysis in tumor-infiltrating T cells, which suppresses tumoricidal effector functions. We discovered a new role for the glycolytic metabolite phosphoenolpyruvate (PEP) in sustaining T cell receptor-mediated Ca2+-NFAT signaling and effector functions by repressing sarco/ER Ca2+-ATPase (SERCA) activity. Tumor-specific CD4 and CD8 T cells could be metabolically reprogrammed by increasing PEP production through overexpression of phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 (PCK1), which bolstered effector functions. Moreover, PCK1-overexpressing T cells restricted tumor growth and prolonged the survival of melanoma-bearing mice. This study uncovers new metabolic checkpoints for T cell activity and demonstrates that metabolic reprogramming of tumor-reactive T cells can enhance anti-tumor T cell responses, illuminating new forms of immunotherapy.

CD4 T cell activation leads to proliferation and differentiation into effector (Teff) or regulatory (Treg) cells that mediate or control immunity. While each subset prefers distinct glycolytic or oxidative metabolic programs in vitro, requirements and mechanisms that control T cell glucose uptake and metabolism in vivo are uncertain. Despite expression of multiple glucose transporters, Glut1 deficiency selectively impaired metabolism and function of thymocytes and Teff. Resting T cells were normal until activated, when Glut1 deficiency prevented increased glucose uptake and glycolysis, growth, proliferation, and decreased Teff survival and differentiation. Importantly, Glut1 deficiency decreased Teff expansion and the ability to induce inflammatory disease in vivo. Treg cells, in contrast, were enriched in vivo and appeared functionally unaffected and able to suppress Teff, irrespective of Glut1 expression. These data show a selective in vivo requirement for Glut1 in metabolic reprogramming of CD4 T cell activation and Teff expansion and survival.

Glucose is a critical component in the proinflammatory response of macrophages (MΦs). However, the contribution of glucose transporters (GLUTs) and the mechanisms regulating subsequent glucose metabolism in the inflammatory response are not well understood. Because MΦs contribute to obesity-induced inflammation, it is important to understand how substrate metabolism may alter inflammatory function. We report that GLUT1 (SLC2A1) is the primary rate-limiting glucose transporter on proinflammatory-polarized MΦs. Furthermore, in high fat diet-fed rodents, MΦs in crown-like structures and inflammatory loci in adipose and liver, respectively, stain positively for GLUT1. We hypothesized that metabolic reprogramming via increased glucose availability could modulate the MΦ inflammatory response. To increase glucose uptake, we stably overexpressed the GLUT1 transporter in RAW264.7 MΦs (GLUT1-OE MΦs). Cellular bioenergetics analysis, metabolomics, and radiotracer studies demonstrated that GLUT1 overexpression resulted in elevated glucose uptake and metabolism, increased pentose phosphate pathway intermediates, with a complimentary reduction in cellular oxygen consumption rates. Gene expression and proteome profiling analysis revealed that GLUT1-OE MΦs demonstrated a hyperinflammatory state characterized by elevated secretion of inflammatory mediators and that this effect could be blunted by pharmacologic inhibition of glycolysis. Finally, reactive oxygen species production and evidence of oxidative stress were significantly enhanced in GLUT1-OE MΦs; antioxidant treatment blunted the expression of inflammatory mediators such as PAI-1 (plasminogen activator inhibitor 1), suggesting that glucose-mediated oxidative stress was driving the proinflammatory response. Our results indicate that increased utilization of glucose induced a ROS-driven proinflammatory phenotype in MΦs, which may play an integral role in the promotion of obesity-associated insulin resistance. Glucose is a critical component in the proinflammatory response of macrophages (MΦs). However, the contribution of glucose transporters (GLUTs) and the mechanisms regulating subsequent glucose metabolism in the inflammatory response are not well understood. Because MΦs contribute to obesity-induced inflammation, it is important to understand how substrate metabolism may alter inflammatory function. We report that GLUT1 (SLC2A1) is the primary rate-limiting glucose transporter on proinflammatory-polarized MΦs. Furthermore, in high fat diet-fed rodents, MΦs in crown-like structures and inflammatory loci in adipose and liver, respectively, stain positively for GLUT1. We hypothesized that metabolic reprogramming via increased glucose availability could modulate the MΦ inflammatory response. To increase glucose uptake, we stably overexpressed the GLUT1 transporter in RAW264.7 MΦs (GLUT1-OE MΦs). Cellular bioenergetics analysis, metabolomics, and radiotracer studies demonstrated that GLUT1 overexpression resulted in elevated glucose uptake and metabolism, increased pentose phosphate pathway intermediates, with a complimentary reduction in cellular oxygen consumption rates. Gene expression and proteome profiling analysis revealed that GLUT1-OE MΦs demonstrated a hyperinflammatory state characterized by elevated secretion of inflammatory mediators and that this effect could be blunted by pharmacologic inhibition of glycolysis. Finally, reactive oxygen species production and evidence of oxidative stress were significantly enhanced in GLUT1-OE MΦs; antioxidant treatment blunted the expression of inflammatory mediators such as PAI-1 (plasminogen activator inhibitor 1), suggesting that glucose-mediated oxidative stress was driving the proinflammatory response. Our results indicate that increased utilization of glucose induced a ROS-driven proinflammatory phenotype in MΦs, which may play an integral role in the promotion of obesity-associated insulin resistance.

Activation of CD4+ T cells results in rapid proliferation and differentiation into effector and regulatory subsets. CD4+ effector T cell (Teff) (Th1 and Th17) and Treg subsets are metabolically distinct, yet the specific metabolic differences that modify T cell populations are uncertain. Here, we evaluated CD4+ T cell populations in murine models and determined that inflammatory Teffs maintain high expression of glycolytic genes and rely on high glycolytic rates, while Tregs are oxidative and require mitochondrial electron transport to proliferate, differentiate, and survive. Metabolic profiling revealed that pyruvate dehydrogenase (PDH) is a key bifurcation point between T cell glycolytic and oxidative metabolism. PDH function is inhibited by PDH kinases (PDHKs). PDHK1 was expressed in Th17 cells, but not Th1 cells, and at low levels in Tregs, and inhibition or knockdown of PDHK1 selectively suppressed Th17 cells and increased Tregs. This alteration in the CD4+ T cell populations was mediated in part through ROS, as N-acetyl cysteine (NAC) treatment restored Th17 cell generation. Moreover, inhibition of PDHK1 modulated immunity and protected animals against experimental autoimmune encephalomyelitis, decreasing Th17 cells and increasing Tregs. Together, these data show that CD4+ subsets utilize and require distinct metabolic programs that can be targeted to control specific T cell populations in autoimmune and inflammatory diseases.

Abstract There is a pressing need for a gonorrhea vaccine due to the high disease burden associated with gonococcal infections globally and the rapid evolution of antibiotic resistance in Neisseria gonorrhoeae ( Ng ). Current gonorrhea vaccine research is in the stages of antigen discovery and the identification of protective immune responses, and no vaccine has been tested in clinical trials in over 30 years. Recently, however, it was reported in a retrospective case-control study that vaccination of humans with a serogroup B Neisseria meningitidis ( Nm ) outer membrane vesicle (OMV) vaccine (MeNZB) was associated with reduced rates of gonorrhea. Here we directly tested the hypothesis that Nm OMVs induce cross-protection against gonorrhea in a well-characterized female mouse model of Ng genital tract infection. We found that immunization with the licensed Nm OMV-based vaccine 4CMenB (Bexsero®) significantly accelerated clearance and reduced the Ng bacterial burden compared to administration of alum or PBS. High titers of serum IgG1 and IgG2a and vaginal IgG1 that cross-reacted with Ng OMVs were induced by vaccination via either the subcutaneous or intraperitoneal routes, and a 4-fold increase in the serum bactericidal 50 titers was detected against the challenge strain. Antibodies from vaccinated mice recognized several surface proteins in a diverse collection of Ng strains, including PilQ, BamA, MtrE, PorB, and Opa, and 4CMenB-induced antibodies bound PilQ and MtrE in native form on the surface of viable bacteria. In contrast, the antibodies were only cross-reactive against lipooligosaccharide species from a few Ng strains. Our findings directly support epidemiological evidence that Nm OMVs confer cross-species protection against Ng and implicate several Ng surface antigens as potentially protective targets. This work also validates the murine infection model as a relevant experimental system for investigating mechanisms of vaccine-mediated protection against gonorrhea. Author summary Over 78 million Neisseria gonorrhoeae (Ng) infections occur globally each year and control of gonorrhea through vaccination is challenged by a lack of strong evidence that immunity to gonorrhea is possible. This contention was recently challenged by epidemiological evidence suggesting that an outer membrane vesicle (OMV) vaccine from the related species Neisseria meningitidis ( Nm ) protected humans against gonorrhea. Here we provide experimental evidence in support of this hypothesis by demonstrating that a licensed, modified version of this Nm OMV-based vaccine accelerates clearance of Ng in a mouse infection model. These results confirm the possibility cross-species protection and are important in that they support the biological feasibility of vaccine-induced immunity against gonorrhea. We also showed that several Ng outer membrane proteins are recognized by antisera from vaccinated mice that may be protective targets of the vaccine. Additionally, our demonstration that a vaccine that may reduce the risk of gonorrhea in humans protects mice against Ng , a highly host-restricted pathogen, validates the mouse model as a potentially useful tool for examining mechanisms of protection, which could be exploited in the development of other candidate gonorrhea vaccines.

Bead array assays, such as those sold by Luminex, BD Biosciences, Sartorius, Abcam and other companies, are a well-established platform for multiplexed quantification of cytokines and other biomarkers in both clinical and discovery research environments. In 2011, the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID)-funded External Quality Assurance Program Oversight Laboratory (EQAPOL) established a proficiency assessment program to monitor participating laboratories performing multiplex cytokine measurements using Luminex bead array technology. During every assessment cycle, each site was sent an assay kit, a protocol, and blinded samples of human sera spiked with recombinant cytokines. Site results were then evaluated for performance relative to peer laboratories. After over a decade of biannual assessments, the cumulative dataset contained over 15,500 bead array observations collected at more than forty laboratories in twelve countries. These data were evaluated alongside post-assessment survey results to empirically test factors that may contribute to variability and accuracy in Luminex bead-based cytokine assays. Bead material, individual technical ability, analyte, analyte concentration, and assay kit vendor were identified as significant contributors to assay performance. In contrast, the bead reader instrument model and the use of automated plate washers were found not to contribute to variability or accuracy, and sample results were found to be highly-consistent between assay kit-manufacturing lots and over time. In addition to these statistical analyses, subjective evaluations identified technical ability, instrument failure, protocol adherence, and data transcription errors as the most common causes of poor performance in the proficiency program. The findings from the EQAPOL multiplex program were then used to develop recommended best practices for bead array monitoring of human cytokines. These included collecting samples to assay as a single batch, centralizing analysis, participating in a quality assurance program, and testing samples using paramagnetic-bead kits from a single manufacturer using a standardized protocol.

Abstract The critical importance of the thymus for generating new naive T cells that protect against novel infections and are tolerant to self-antigens has led to a recent revival of interest in monitoring thymic function in species other than humans and mice. Nonhuman primates such as rhesus macaques (Macaca mulatta) provide particularly useful animal models for translational research in immunology. In this study, we tested the performance of a 15-marker multicolor Ab panel for flow cytometric phenotyping of lymphocyte subsets directly from rhesus whole blood, with validation by thymectomy and T cell depletion. Immunohistochemical and multiplex RNA expression analysis of thymus tissue biopsies and molecular assays on PBMCs were used to further validate thymus function. Results identify Ab panels that can accurately classify rhesus naive T cells (CD3+CD45RA+CD197+ or CD3+CD28+CD95−) and recent thymic emigrants (CD8+CD28+CD95−CD103+CD197+) using just 100 µl of whole blood and commercially available fluorescent Abs. An immunohistochemical panel reactive with pan-cytokeratin (CK), CK14, CD3, Ki-67, CCL21, and TdT provides histologic evidence of thymopoiesis from formalin-fixed, paraffin-embedded thymus tissues. Identification of mRNAs characteristic of both functioning thymic epithelial cells and developing thymocytes and/or molecular detection of products of TCR gene rearrangement provide additional complementary methods to evaluate thymopoiesis, without requiring specific Abs. Combinations of multiparameter flow cytometry, immunohistochemistry, multiplex gene expression, and TCR excision circle assays can comprehensively evaluate thymus function in rhesus macaques while requiring only minimal amounts of peripheral blood or biopsied thymus tissue.

Abstract Nucleic acid vaccines play important roles in the prevention and treatment of diseases. However, limited immunogenicity remains a major obstacle for DNA vaccine applications in the clinic. To address the issue, the present study investigates a cocktail approach to DNA vaccination. In this proof‐of‐the‐concept study, the cocktail consists of two DNAs encoding viral hemagglutinin (HA) and granulocyte‐macrophage colony stimulatory factor (GM‐CSF), respectively. Data from the study demonstrate that recruitment and activation of antigen‐presenting cells (APCs) can be substantially improved by spatiotemporal regulation of GM‐CSF and HA expressions at the site of vaccination. The types of recruited APCs and their phenotypes are also controllable by adjusting the cocktail compositions. Compared to the mono‐ingredient vaccine, the optimized cocktail vaccine is able to enhance the anti‐viral humoral and T cell immune responses. No significant systemic inflammation is detected after either prime or boost immunization using the cocktail vaccine. Data in the study suggest that the DNA cocktail is a safe, effective, and controllable platform for improving vaccine efficacy.