Prion-like low-complexity domains (PLCDs) have distinctive sequence grammars that determine their driving forces for phase separation. Here we uncover the physicochemical underpinnings of how evolutionarily conserved compositional biases influence the phase behaviour of PLCDs. We interpret our results in the context of the stickers-and-spacers model for the phase separation of associative polymers. We find that tyrosine is a stronger sticker than phenylalanine, whereas arginine is a context-dependent auxiliary sticker. In contrast, lysine weakens sticker–sticker interactions. Increasing the net charge per residue destabilizes phase separation while also weakening the strong coupling between single-chain contraction in dilute phases and multichain interactions that give rise to phase separation. Finally, glycine and serine residues act as non-equivalent spacers, and thus make the glycine versus serine contents an important determinant of the driving forces for phase separation. The totality of our results leads to a set of rules that enable comparative estimates of composition-specific driving forces for PLCD phase separation. The complex link between protein sequence and phase behaviour for a family of prion-like low-complexity domains (PLCDs) has now been revealed. The results have uncovered a set of rules—which are interpreted using a stickers-and-spacers model—that govern the sequence-encoded phase behaviour of such PLCDs and enable physicochemical rationalizations that are connected to the underlying sequence composition.

Abstract Phase separation of intrinsically disordered prion-like low-complexity domains (PLCDs) derived from RNA-binding proteins enable the formation of biomolecular condensates in cells. PLCDs have distinct amino acid compositions, and here we decipher the physicochemical impact of conserved compositional biases on the driving forces for phase separation. We find that tyrosine residues make for stronger drivers of phase separation than phenylalanine. Depending on their sequence contexts, arginine residues enhance or weaken phase separation, whereas lysine residues weaken cohesive interactions within PLCDs. Increased net charge per residue (NCPR) weakens the driving forces for phase separation of PLCDs and this effect can be modeled quantitatively. The effects of NCPR also weaken known correlations between the dimensions of single chains in dilute solution and the driving forces for phase separation. We build on experimental data to develop a coarse-grained model for accurate simulations of phase separation that yield novel insights regarding PLCD phase behavior.

The formation of membraneless biomolecular condensates is driven by macromolecules with sticker-and-spacer architectures that undergo phase separation coupled to percolation (PSCP). Driving forces for PSCP are governed by the interplay between reversible inter-sticker crosslinks and solvation preferences of spacers. Here, we introduce molecular and mesoscale descriptions of structures within, outside, and at the interfaces of condensates that are formed by prion-like low complexity domains (PLCDs), which are exemplars of intrinsically disordered, linear multivalent proteins. Our studies are based on simulations that accurately describe sequence-specific phase behaviors of PLCDs. We find that networks of reversible, intermolecular, inter-sticker crosslinks organize PLCDs into small-world topologies within condensates. These topologies result from distinct conformational preferences within dense, dilute, and interfacial regions. Specifically, the degree of conformational expansion varies non-monotonically, being most expanded at the interface and most compact in the dilute phase with molecules preferring to be oriented perpendicular to condensate interfaces. This contrasts with dense and dilute phases where molecules are randomly oriented relative to one another. Our results demonstrate that even simple condensates, with only one type of macromolecule, feature inhomogeneous spatial organizations of molecules and interfacial features that likely prime them for being locations of biochemical activity.

ABSTRACT Many disordered proteins conserve essential functions in the face of extensive sequence variation. This makes it challenging to identify the forces responsible for functional selection. Viruses are robust model systems to investigate functional selection and they take advantage of protein disorder to acquire novel traits. Here, we combine structural and computational biophysics with evolutionary analysis to determine the molecular basis for functional selection in the intrinsically disordered adenovirus early gene 1A (E1A) protein. E1A competes with host factors to bind the retinoblastoma (Rb) protein, triggering early S-phase entry and disrupting normal cellular proliferation. We show that the ability to outcompete host factors depends on the picomolar binding affinity of E1A for Rb, which is driven by two binding motifs tethered by a hypervariable disordered linker. Binding affinity is determined by the spatial dimensions of the linker, which constrain the relative position of the two binding motifs. Despite substantial sequence variation across evolution, the linker dimensions are finely optimized through compensatory changes in amino acid sequence and sequence length, leading to conserved linker dimensions and maximal affinity. We refer to the mechanism that conserves spatial dimensions despite large-scale variations in sequence as conformational buffering. Conformational buffering explains how variable disordered proteins encode functions and could be a general mechanism for functional selection within disordered protein regions.

Abstract Over the last decade, evidence has accumulated to suggest that numerous instances of cellular compartmentalization can be explained by the phenomenon of phase separation. This is a process by which a macromolecular solution separates spontaneously into dense and dilute coexisting phases. Semi-quantitative, in vitro approaches for measuring phase boundaries have proven very useful in determining some key features of biomolecular condensates, but these methods often lack the precision necessary for generating quantitative models. Therefore, there is a clear need for techniques that allow quantitation of coexisting dilute and dense phase concentrations of phase-separating biomolecules, especially in systems with more than one type of macromolecule. Here we report the design and deployment of analytical High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) for in vitro separation and quantification of distinct biomolecules that allows us to measure dilute and dense phase concentrations needed to reconstruct coexistence curves in multicomponent mixtures. This approach is label-free, detects lower amounts of material than is accessible with classic UV-spectrophotometers, is applicable to a broad range of macromolecules of interest, is a semi-high-throughput technique, and if needed, the macromolecules can be recovered for further use. The approach promises to provide quantitative insights into the balance of homotypic and heterotypic interactions in multicomponent phase-separating systems.

Biomolecular condensates have been identified as a ubiquitous means of intracellular organization, exhibiting very diverse material properties. However, techniques to characterize these material properties and their underlying molecular interactions are scarce. Here, we introduce two optical techniques – Brillouin microscopy and quantitative phase imaging (QPI) – to address this scarcity. We establish Brillouin shift and linewidth as measures for average molecular interaction and dissipation strength, respectively, and we used QPI to obtain the protein concentration within the condensates. We monitored the response of condensates formed by FUS and by the low-complexity domain of hnRNPA1 (A1-LCD) to altering temperature and ion concentration. Conditions favoring phase separation increased Brillouin shift, linewidth, and protein concentration. In comparison to solidification by chemical crosslinking, the ion-dependent aging of FUS condensates had a small effect on the molecular interaction strength inside. Finally, we investigated how sequence variations of A1-LCD, that change the driving force for phase separation, alter the physical properties of the respective condensates. Our results provide a new experimental perspective on the material properties of protein condensates. Robust and quantitative experimental approaches such as the presented ones will be crucial for understanding how the physical properties of biological condensates determine their function and dysfunction.

Abstract Prion-like low-complexity domains (PLCDs) are involved in the formation and regulation of distinct biomolecular condensates that form via coupled associative and segregative phase transitions. We previously deciphered how evolutionarily conserved sequence features drive phase separation of PLCDs through homotypic interactions. However, condensates typically encompass a diverse mixture of proteins with PLCDs. Here, we combine simulations and experiments to study mixtures of PLCDs from two RNA binding proteins namely, hnRNPA1 and FUS. We find that 1:1 mixtures of the A1-LCD and FUS-LCD undergo phase separation more readily than either of the PLCDs on their own. The enhanced driving forces for phase separation of mixtures of A1-LCD and FUS-LCD arise partly from complementary electrostatic interactions between the two proteins. This complex coacervation-like mechanism adds to complementary interactions among aromatic residues. Further, tie line analysis shows that stoichiometric ratios of different components and their sequence-encoded interactions jointly contribute to the driving forces for condensate formation. These results highlight how expression levels might be tuned to regulate the driving forces for condensate formation in vivo . Simulations also show that the organization of PLCDs within condensates deviates from expectations based on random mixture models. Instead, spatial organization within condensates will reflect the relative strengths of homotypic versus heterotypic interactions. We also uncover rules for how interaction strengths and sequence lengths modulate conformational preferences of molecules at interfaces of condensates formed by mixtures of proteins. Overall, our findings emphasize the network-like organization of molecules within multicomponent condensates, and the distinctive, composition-specific conformational features of condensate interfaces. Significance Statement Biomolecular condensates are mixtures of different protein and nucleic acid molecules that organize biochemical reactions in cells. Much of what we know about how condensates form comes from studies of phase transitions of individual components of condensates. Here, we report results from studies of phase transitions of mixtures of archetypal protein domains that feature in distinct condensates. Our investigations, aided by a blend of computations and experiments, show that the phase transitions of mixtures are governed by a complex interplay of homotypic and heterotypic interactions. The results point to how expression levels of different protein components can be tuned in cells to modulate internal structures, compositions, and interfaces of condensates, thus affording distinct ways to control the functions of condensates.

Abstract Biomolecular condensates have recently been identified as a ubiquitous means of intracellular organization. Investigating the molecular interactions determining the formation, and physical properties of biomolecular condensates provides key insights for understanding their biological function, and dysfunction. Here, we applied Brillouin microscopy and quantitative phase imaging to quantify average molecular interaction strength, dry mass density, and protein volume fraction in protein condensates in vitro. We monitored the physical changes in FUS condensates in response to altering temperature and ion concentration. Conditions favoring phase separation increased Brillouin shift, linewidth, and dry mass density. In contrast to solidification by chemical crosslinking, physical aging of condensates had only a small impact on the Brillouin shift. Physical aging was suppressed at a high ion concentration. Finally, we characterized sequence variations of the low-complexity domain of hnRNPA1 that change the driving force for phase separation and found that they also alter the physical properties of the condensates. Our results provide a new experimental perspective on the physical properties of protein condensates and their sensitivity to solution conditions, sequence, and as a function of time.

Abstract We demonstrate that nascent versus aged condensates formed by prion-like low complexity domains (PLCDs) are distinct types of viscoelastic materials. Nascent PLCD condensates are terminally viscous Maxwell fluids whose viscoelastic moduli are governed by the strengths of aromatic stickers. Upon physical aging, PLCD condensates transition, on sequence-specific timescales, from fluids to non-fibrillar, elastic Kelvin-Voigt solids. Accordingly, fluid-like condensates of PLCDs are metastable, whereas elastic solids are the stable material states. Fluid-to-solid transitions are accelerated by mutations to spacers that weaken metastable fluids with respect to stable solids. Evolutionarily selected PLCD sequence features that enhance the metastabilities of fluid-like condensates are likely to render the barriers for conversion from fluids to solids to be insurmountable on timescales that are relevant to cellular processes.