Abstract Compared to its predecessors, the Telomere-to-Telomere CHM13 genome adds nearly 200 Mbp of sequence, corrects thousands of structural errors, and unlocks the most complex regions of the human genome to clinical and functional study. Here we demonstrate how the new reference universally improves read mapping and variant calling for 3,202 and 17 globally diverse samples sequenced with short and long reads, respectively. We identify hundreds of thousands of novel variants per sample—a new frontier for evolutionary and biomedical discovery. Simultaneously, the new reference eliminates tens of thousands of spurious variants per sample, including up to 12-fold reduction of false positives in 269 medically relevant genes. The vast improvement in variant discovery coupled with population and functional genomic resources position T2T-CHM13 to replace GRCh38 as the prevailing reference for human genetics. One Sentence Summary The T2T-CHM13 reference genome universally improves the analysis of human genetic variation.

As a step towards simplifying and reducing the cost of haplotype resolved de novo assembly, we describe new methods for accurately phasing nanopore data with the Shasta genome assembler and a modular tool for extending phasing to the chromosome scale called GFAse. We test using new variants of Oxford Nanopore Technologies' (ONT) PromethION sequencing, including those using proximity ligation and show that newer, higher accuracy ONT reads substantially improve assembly quality.

Long-read sequencing technologies substantially overcome the limitations of short-reads but to date have not been considered as feasible replacement at scale due to a combination of being too expensive, not scalable enough, or too error-prone. Here, we develop an efficient and scalable wet lab and computational protocol for Oxford Nanopore Technologies (ONT) long-read sequencing that seeks to provide a genuine alternative to short-reads for large-scale genomics projects. We applied our protocol to cell lines and brain tissue samples as part of a pilot project for the NIH Center for Alzheimer’s and Related Dementias (CARD). Using a single PromethION flow cell, we can detect SNPs with F1-score better than Illumina short-read sequencing. Small indel calling remains difficult within homopolymers and tandem repeats, but is comparable to Illumina calls elsewhere. Further, we can discover structural variants with F1-score comparable to state-of-the-art methods involving Pacific Biosciences HiFi sequencing and trio information (but at a lower cost and greater throughput). Using ONT-based phasing, we can then combine and phase small and structural variants at megabase scales. Our protocol also produces highly accurate, haplotype-specific methylation calls. Overall, this makes large-scale long-read sequencing projects feasible; the protocol is currently being used to sequence thousands of brain-based genomes as a part of the NIH CARD initiative. We provide the protocol and software as open-source integrated pipelines for generating phased variant calls and assemblies.

DNA methylation most commonly occurs as 5-methylcytosine (5-mC) in the human genome and has been associated with human diseases. Recent developments in single-molecule sequencing technologies (Oxford Nanopore Technologies (ONT) and Pacific Biosciences) have enabled readouts of long, native DNA molecules, including cytosine methylation. ONT recently upgraded their Nanopore sequencing chemistry and kits from R9 to the R10 version, which yielded increased accuracy and sequencing throughput. However the effects on methylation detection have not yet been documented. Here we performed a series of computational analyses to characterize differences in Nanopore-based 5mC detection between the ONT R9 and R10 chemistries. We compared 5mC calls in R9 and R10 for three human genome datasets: a cell line, a frontal cortex brain sample, and a blood sample. We performed an in-depth analysis on CpG islands and homopolymer regions, and documented high concordance for methylation detection among sequencing technologies. The strongest correlation was observed between Nanopore R10 and Illumina bisulfite technologies for cell line-derived datasets. Subtle differences in methylation datasets between technologies can impact analysis tools such as differential methylation calling software. Our findings show that comparisons can be drawn between methylation data from different Nanopore chemistries using guided hypotheses. This work will facilitate comparison among Nanopore data cohorts derived using different chemistries from large scale sequencing efforts, such as the NIH CARD Long Read Initiative.