The human brain directs a wide range of complex behaviors ranging from fine motor skills to abstract intelligence and emotion. However, the diversity of cell types that support these skills has not been fully described. Here we used high-throughput single-nucleus RNA sequencing to systematically survey cells across the entire adult human brain in three postmortem donors. We sampled over three million nuclei from approximately 100 dissections across the forebrain, midbrain, and hindbrain. Our analysis identified 461 clusters and 3313 subclusters organized largely according to developmental origins. We found area-specific cortical neurons, as well as an unexpectedly high diversity of midbrain and hindbrain neurons. Astrocytes also exhibited regional diversity at multiple scales, comprising subtypes specific to the telencephalon and to more precise anatomical locations. Oligodendrocyte precursors comprised two distinct major types specific to the telencephalon and to the rest of the brain. Together, these findings demonstrate the unique cellular composition of the telencephalon with respect to all major brain cell types. As the first single-cell transcriptomic census of the entire human brain, we provide a resource for understanding the molecular diversity of the human brain in health and disease.

The adult human brain likely comprises more than a thousand kinds of neurons, and an unknown number of glial cell types, but how cellular diversity arises during early brain development is not known. Here, in order to reveal the precise sequence of events during early brain development, we used single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics to uncover cell states and trajectories in human brains at 5 – 14 post-conceptional weeks (p.c.w.). We identified twelve major classes and over 600 distinct cell states, which mapped to precise spatial anatomical domains at 5 p.c.w. We uncovered detailed differentiation trajectories of the human forebrain, and a surprisingly large number of region-specific glioblasts maturing into distinct pre-astrocytes and pre-oligodendrocyte precursor cells (pre-OPCs). Our findings reveal the emergence of cell types during the critical first trimester of human brain development.

Abstract Human induced pluripotent stem cell (iPSC) lines are a powerful tool for studying development and disease, but the considerable phenotypic variation between lines makes it challenging to replicate key findings and integrate data across research groups. To address this issue, we sub-cloned candidate iPSC lines and deeply characterised their genetic properties using whole genome sequencing, their genomic stability upon CRISPR/Cas9-based gene editing, and their phenotypic properties including differentiation to commonly-used cell types. These studies identified KOLF2.1J as an all-around well-performing iPSC line. We then shared KOLF2.1J with groups around the world who tested its performance in head-to-head comparisons with their own preferred iPSC lines across a diverse range of differentiation protocols and functional assays. On the strength of these findings, we have made KOLF2.1J and hundreds of its gene-edited derivative clones readily accessible to promote the standardization required for large-scale collaborative science in the stem cell field. Summary The authors of this collaborative study deeply characterized human induced pluripotent stem cell (iPSC) lines to rationally select a clonally-derived cell line that performs well across multiple modalities. KOLF2.1J was identified as a candidate reference cell line based on single-cell analysis of its gene expression in the pluripotent state, whole genome sequencing, genomic stability after highly efficient CRISPR-mediated gene editing, integrity of the p53 pathway, and the efficiency with which it differentiated into multiple target cell populations. Since it is deeply characterized and can be readily acquired, KOLF2.1J is an attractive reference cell line for groups working with iPSCs. Graphical abstract

ABSTRACT The choroid plexus (ChP) produces cerebrospinal fluid and forms a critical barrier between the brain and the circulation. While the ChP forms in each brain ventricle, it adopts a different shape in each one and remarkably little is known about the mechanisms underlying its development. Here, we show that epithelial WNT5A is critical for determining fourth ventricle (4V) ChP morphogenesis and size. Systemic Wnt5a knockout, or forced WNT5A overexpression beginning at E10.5, profoundly reduced the size and development of ChP in all ventricles. However, conditional deletion of Wnt5a expression in Foxj1 -expressing epithelial cells affected only the branched, villous morphology of the 4V ChP. We found that WNT5A was enriched in epithelial cells localized to the distal tips of 4V ChP villi, where WNT5A acted locally to activate non-canonical Wnt signaling via Ror1/Ror2 receptors. During 4V ChP development, MEIS1 bound to the proximal Wnt5a promoter, and gain- and loss-of-function approaches demonstrated that MEIS1 regulated Wnt5a expression. Collectively, our findings demonstrate a dual function of WNT5A in ChP development and identify MEIS1 and MEIS2 as upstream regulators of Wnt5a in the 4V ChP epithelium.

ABSTRACT Midbrain dopaminergic (mDA) neurons degenerate in Parkinson’s disease and are one of the main targets for cell replacement therapies. However, a comprehensive view of the signals and cell types contributing to mDA neurogenesis is not yet available. By analyzing the transcriptome of the mouse ventral midbrain at a tissue and single-cell level during mDA neurogenesis we found that three recently identified radial glia types 1-3 (Rgl1-3) contribute to different key aspects of mDA neurogenesis. While Rgl3 expressed most extracellular matrix components and multiple ligands for various pathways controlling mDA neuron development, such as Wnt and Shh, Rgl1-2 expressed most receptors. Moreover, we found that specific transcription factor networks explain the transcriptome and suggest a function for each individual radial glia. A network controlling neurogenesis was found in Rgl1, progenitor maintenance in Rgl2 and the secretion of factors forming the mDA niche by Rgl3. Our results thus uncover a broad repertoire of developmental signals expressed by each midbrain cell type during mDA neurogenesis. Cells identified for their emerging importance are Rgl3, a niche cell type, and Rgl1, a neurogenic progenitor that expresses ARNTL, a transcription factor that we find is required for mDA neurogenesis.

The mammalian nervous system executes complex behaviors controlled by specialised, precisely positioned and interacting cell types. Here, we used RNA sequencing of half a million single cells to create a detailed census of cell types in the mouse nervous system. We mapped cell types spatially and derived a hierarchical, data-driven taxonomy. Neurons were the most diverse, and were grouped by developmental anatomical units, and by the expression of neurotransmitters and neuropeptides. Neuronal diversity was driven by genes encoding cell identity, synaptic connectivity, neurotransmission and membrane conductance. We discovered several distinct, regionally restricted, astrocytes types, which obeyed developmental boundaries and correlated with the spatial distribution of key glutamate and glycine neurotransmitters. In contrast, oligodendrocytes showed a loss of regional identity, followed by a secondary diversi cation. The resource presented here lays a solid foundation for understanding the molecular architecture of the mammalian nervous system, and enables genetic manipulation of specific cell types.

Genome-wide association studies (GWAS) have discovered hundreds of loci associated with complex brain disorders, and provide the best current insights into the etiology of these idiopathic traits. However, it remains unclear in which cell types these variants are active, which is essential for understanding etiology and subsequent experimental modeling. Here we integrate GWAS results with single-cell transcriptomic data from the entire mouse nervous system to systematically identify cell types underlying psychiatric disorders, neurological diseases, and brain complex traits. We show that psychiatric disorders are predominantly associated with cortical and hippocampal excitatory neurons, as well as medium spiny neurons from the striatum. Cognitive traits were generally associated with similar cell types but their associations were driven by different genes. Neurological diseases were associated with different cell types, which is consistent with other lines of evidence. Notably, we found that Parkinson’s disease is not only genetically associated with cholinergic and monoaminergic neurons (which include dopaminergic neurons from the substantia nigra) but also with neurons from the enteric system and oligodendrocytes. Using post-mortem brain transcriptomic data, we confirmed alterations in these cells, even at the earliest stages of disease progression. Our study provides an important framework for understanding the cellular basis of complex brain maladies, and reveals an unexpected role of oligodendrocytes in Parkinson’s disease.

Abstract Understanding midbrain dopaminergic (mDA) neuron development is key to advancing cell replacement therapies for Parkinson’s disease (PD). Recent single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) studies have identified different subtypes of transient radial glia (Rgl) cell types in the developing mouse and human ventral midbrain. However, their individual functions and their impact on mDA neuron development are unclear. Here we analyze the transcriptome of endogenous mouse and human ventral midbrain Rgl and assess the function of key midbrain floor plate Rgl factors in human stem cells during mDA neuron differentiation. We find that Rgl1 is defined by a neurogenic network centered on Arntl , and that this transcription factor regulates human mDA neurogenesis. Conversely, the transcriptome of Rgl3 is dominated by signaling and extracellular matrix molecules that control different aspects of human mDA neuron development. Thus, our results suggest a function of Rgl1 as a mDA progenitor, and of Rgl3 as a signaling mDA niche cell. Moreover, using human stem cells we demonstrate that new knowledge of cell-type specific intrinsic and extrinsic developmental factors can readily be applied to improve the generation of cells with therapeutic interest, such as human mDA neurons for PD.

Summary The presence of serotonergic system during early pre-neural development is enigmatic and conserved amongst all studied invertebrate and vertebrate animals. We took advantage of zebrafish model system to address what is the role of early serotonin before first neurons form. Unexpectedly, we experimentally revealed the existence of delayed developmental neurogenic and behavioral effects resulting from the manipulations of pre-neural (zygote, blastula and gastrula) serotonergic system. In particular, the delayed effects included differences in the synthesis of serotonin in early serotonergic neurons in the central nervous system as well as in behavioral alterations after habituation in zebrafish larvae. These effects appeared as highly specific and did not coincide with any major abnormalities. The same manipulations of the serotonergic system at neural developmental stages did not show such effects, which confirms that early effects of serotonergic system manipulation are not based on retained serotonin in embryonic cells. Accordingly, gene expression analysis demonstrated specific changes only in response to the elevation of early pre-neural serotonin, which included the delayed and pre-mature onsets of different gene expression programs. Taken together, our results introduce a novel function of early pre-neural serotonergic system in a vertebrate embryo – tuning and fine control of specific mechanisms at later neural developmental stages that result in a mild variation of a behavioral adaptive spectrum.

Summary Stem cell technologies provide new opportunities for modeling cells in the healthy and diseased states and for regenerative medicine. In both cases developmental knowledge as well as the quality and molecular properties of the cells are essential for their future application. In this study we identify developmental factors important for the differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) into midbrain dopaminergic (mDA) neurons. We found that Laminin-511, and dual canonical and non-canonical WNT activation followed by GSK3β inhibition plus FGF8b, improved midbrain patterning. In addition, mDA neurogenesis and differentiation was enhanced by activation of liver X receptors and inhibition of fibroblast growth factor signaling. Moreover, single-cell RNA-sequencing analysis revealed a developmental dynamics similar to that of the endogenous human ventral midbrain and the emergence of high quality molecularly-defined midbrain cell types, including mDA neurons that become functional. Thus, our study identifies novel factors important for human midbrain development and opens the door for a future application of molecularly-defined hESC-derived midbrain cell types in Parkinson’s disease.