The incomplete identification of structural variants (SVs) from whole-genome sequencing data limits studies of human genetic diversity and disease association. Here, we apply a suite of long-read, short-read, strand-specific sequencing technologies, optical mapping, and variant discovery algorithms to comprehensively analyze three trios to define the full spectrum of human genetic variation in a haplotype-resolved manner. We identify 818,054 indel variants (<50 bp) and 27,622 SVs (≥50 bp) per genome. We also discover 156 inversions per genome and 58 of the inversions intersect with the critical regions of recurrent microdeletion and microduplication syndromes. Taken together, our SV callsets represent a three to sevenfold increase in SV detection compared to most standard high-throughput sequencing studies, including those from the 1000 Genomes Project. The methods and the dataset presented serve as a gold standard for the scientific community allowing us to make recommendations for maximizing structural variation sensitivity for future genome sequencing studies.

Resolving genomic structural variation Many human genomes have been reported using short-read technology, but it is difficult to resolve structural variants (SVs) using these data. These genomes thus lack comprehensive comparisons among individuals and populations. Ebert et al. used long-read structural variation calling across 64 human genomes representing diverse populations and developed new methods for variant discovery. This approach allowed the authors to increase the number of confirmed SVs and to describe the patterns of variation across populations. From this dataset, they identified quantitative trait loci affected by these SVs and determined how they may affect gene expression and potentially explain genome-wide association study hits. This information provides insights into patterns of normal human genetic variation and generates reference genomes that better represent the diversity of our species. Science , this issue p. eabf7117

In order to provide a comprehensive resource for human structural variants (SVs), we generated long-read sequence data and analyzed SVs for fifteen human genomes. We sequence resolved 99,604 insertions, deletions, and inversions including 2,238 (1.6 Mbp) that are shared among all discovery genomes with an additional 13,053 (6.9 Mbp) present in the majority, indicating minor alleles or errors in the reference. Genotyping in 440 additional genomes confirms the most common SVs in unique euchromatin are now sequence resolved. We report a ninefold SV bias toward the last 5 Mbp of human chromosomes with nearly 55% of all VNTRs (variable number of tandem repeats) mapping to this portion of the genome. We identify SVs affecting coding and noncoding regulatory loci improving annotation and interpretation of functional variation. These data provide the framework to construct a canonical human reference and a resource for developing advanced representations capable of capturing allelic diversity.

ABSTRACT The incomplete identification of structural variants (SVs) from whole-genome sequencing data limits studies of human genetic diversity and disease association. Here, we apply a suite of long-read, short-read, and strand-specific sequencing technologies, optical mapping, and variant discovery algorithms to comprehensively analyze three human parent–child trios to define the full spectrum of human genetic variation in a haplotype-resolved manner. We identify 818,054 indel variants (<50 bp) and 27,622 SVs (≥50 bp) per human genome. We also discover 156 inversions per genome—most of which previously escaped detection. Fifty-eight of the inversions we discovered intersect with the critical regions of recurrent microdeletion and microduplication syndromes. Taken together, our SV callsets represent a sevenfold increase in SV detection compared to most standard high-throughput sequencing studies, including those from the 1000 Genomes Project. The method and the dataset serve as a gold standard for the scientific community and we make specific recommendations for maximizing structural variation sensitivity for future large-scale genome sequencing studies.

A bstract Typical analysis workflows map reads to a reference genome in order to detect genetic variants. Generating such alignments introduces references biases, in particular against insertion alleles absent in the reference and comes with substantial computational burden. In contrast, recent k-mer-based genotyping methods are fast, but struggle in repetitive or duplicated regions of the genome. We propose a novel algorithm, called PanGenie, that leverages a pangenome reference built from haplotype-resolved genome assemblies in conjunction with k-mer count information from raw, short-read sequencing data to genotype a wide spectrum of genetic variation. The given haplotypes enable our method to take advantage of linkage information to aid genotyping in regions poorly covered by unique k-mers and provides access to regions otherwise inaccessible by short reads. Compared to classic mapping-based approaches, our approach is more than 4× faster at 30× coverage and at the same time, reached significantly better genotype concordances for almost all variant types and coverages tested. Improvements are especially pronounced for large insertions (> 50bp), where we are able to genotype > 99.9% of all tested variants with over 90% accuracy at 30× short-read coverage, where the best competing tools either typed less than 60% of variants or reached accuracies below 70%. PanGenie now enables the inclusion of this commonly neglected variant type in downstream analyses.

Abstract Unlike copy number variants (CNVs), inversions remain an underexplored genetic variation class. By integrating multiple genomic technologies, we discover 729 inversions in 41 human genomes. Approximately 85% of inversions <2 kbp form by twin-priming during L1-retrotransposition; 80% of the larger inversions are balanced and affect twice as many base pairs as CNVs. Balanced inversions show an excess of common variants, and 72% are flanked by segmental duplications (SDs) or mobile elements. Since this suggests recurrence due to non-allelic homologous recombination, we developed complementary approaches to identify recurrent inversion formation. We describe 40 recurrent inversions encompassing 0.6% of the genome, showing inversion rates up to 2.7×10 -4 per locus and generation. Recurrent inversions exhibit a sex- chromosomal bias, and significantly co-localize to the critical regions of genomic disorders. We propose that inversion recurrence results in an elevated number of heterozygous carriers and structural SD diversity, which increases mutability in the population and predisposes to disease- causing CNVs.

Abstract The prevalence of highly repetitive sequences within the human Y chromosome has led to its incomplete assembly and systematic omission from genomic analyses. Here, we present long-read de novo assemblies of 43 diverse Y chromosomes spanning 180,000 years of human evolution, including two from deep-rooted African Y lineages, and report remarkable complexity and diversity in chromosome size and structure, in contrast with its low level of base substitution variation. The size of the Y chromosome assemblies varies extensively from 45.2 to 84.9 Mbp and include, on average, 81 kbp of novel sequence per Y chromosome. Half of the male-specific euchromatic region is subject to large inversions with a >2-fold higher recurrence rate compared to inversions in the rest of the human genome. Ampliconic sequences associated with these inversions further show differing mutation rates that are sequence context-dependent and some ampliconic genes show evidence for concerted evolution with the acquisition and purging of lineage-specific pseudogenes. The largest heterochromatic region in the human genome, the Yq12, is composed of alternating arrays of DYZ1 and DYZ2 repeat units that show extensive variation in the number, size and distribution of these arrays, but retain a 1:1 copy number ratio of the monomer repeats, consistent with the notion that functional or evolutionary forces are acting on this chromosomal region. Finally, our data suggests that the boundary between the recombining pseudoautosomal region 1 and the non-recombining portions of the X and Y chromosomes lies 500 kbp distal to the currently established boundary. The availability of sequence-resolved Y chromosomes from multiple individuals provides a unique opportunity for identifying new associations of specific traits with Y-chromosomal variants and garnering novel insights into the evolution and function of complex regions of the human genome.

Abstract Virtually all genome sequencing efforts in national biobanks, complex and Mendelian disease programs, and emerging clinical diagnostic approaches utilize short-reads (srWGS), which present constraints for genome-wide discovery of structural variants (SVs). Alternative long-read single molecule technologies (lrWGS) offer significant advantages for genome assembly and SV detection, while these technologies are currently cost prohibitive for large-scale disease studies and clinical diagnostics (∼5-12X higher cost than comparable coverage srWGS). Moreover, only dozens of such genomes are currently publicly accessible by comparison to millions of srWGS genomes that have been commissioned for international initiatives. Given this ubiquitous reliance on srWGS in human genetics and genomics, we sought to characterize and quantify the properties of SVs accessible to both srWGS and lrWGS to establish benchmarks and expectations in ongoing medical and population genetic studies, and to project the added value of SVs uniquely accessible to each technology. In analyses of three trios with matched srWGS and lrWGS from the Human Genome Structural Variation Consortium (HGSVC), srWGS captured ∼11,000 SVs per genome using reference-based algorithms, while haplotype-resolved assembly from lrWGS identified ∼25,000 SVs per genome. Detection power and precision for SV discovery varied dramatically by genomic context and variant class: 9.7% of the current GRCh38 reference is defined by segmental duplications (SD) and simple repeats (SR), yet 91.4% of deletions that were specifically discovered by lrWGS localized to these regions. Across the remaining 90.3% of the human reference, we observed extremely high concordance (93.8%) for deletions discovered by srWGS and lrWGS after error correction using the raw lrWGS reads. Conversely, lrWGS was superior for detection of insertions across all genomic contexts. Given that the non-SD/SR sequences span 90.3% of the GRCh38 reference, and encompass 95.9% of coding exons in currently annotated disease associated genes, improved sensitivity from lrWGS to discover novel and interpretable pathogenic deletions not already accessible to srWGS is likely to be incremental. However, these analyses highlight the added value of assembly-based lrWGS to create new catalogues of functional insertions and transposable elements, as well as disease associated repeat expansions in genomic regions previously recalcitrant to routine assessment.

Abstract Long-read and strand-specific sequencing technologies together facilitate the de novo assembly of high-quality haplotype-resolved human genomes without parent–child trio data. We present 64 assembled haplotypes from 32 diverse human genomes. These highly contiguous haplotype assemblies (average contig N50: 26 Mbp) integrate all forms of genetic variation across even complex loci such as the major histocompatibility complex. We focus on 107,590 structural variants (SVs), of which 68% are inaccessible by short-read sequencing. We identify new SV hotspots (spanning megabases of gene-rich sequence), characterize 130 of the most active mobile element source elements, and find that 63% of all SVs arise by homology-mediated mechanisms—a twofold increase from previous studies. Our resource now enables reliable graph-based genotyping from short reads of up to 50,340 SVs, resulting in the identification of 1,525 expression quantitative trait loci (SV-eQTLs) as well as SV candidates for adaptive selection within the human population.

SUMMARY Diverse inbred mouse strains are among the foremost models for biomedical research, yet genome characterization of many strains has been fundamentally lacking in comparison to human genomics research. In particular, the discovery and cataloging of structural variants is incomplete, limiting the discovery of potentially causative alleles for phenotypic variation across individuals. Here, we utilized long-read sequencing to resolve genome-wide structural variants (SVs, variants ≥ 50 bp) in 20 genetically distinct inbred mice. We report 413,758 site-specific SVs that affect 13% (356 Mbp) of the current mouse reference assembly, including 510 previously unannotated variants which alter coding sequences. We find that 39% of SVs are attributed to transposable element (TE) variation accounting for 75% of bases altered by SV. We then utilized this callset to investigate the impact of TE heterogeneity on mouse embryonic stem cells (mESCs), and find multiple TE classes that influence chromatin accessibility across loci. We also identify strain-specific transcription start sites originating in polymorphic TEs that modify gene expression. Our work provides the first long-read based analysis of mouse SVs and illustrates that previously unresolved TEs underlie epigenetic and transcriptome differences in mESCs.