PD-1 blockade unleashes CD8 T cells1, including those specific for mutation-associated neoantigens (MANA), but factors in the tumour microenvironment can inhibit these T cell responses. Single-cell transcriptomics have revealed global T cell dysfunction programs in tumour-infiltrating lymphocytes (TIL). However, the majority of TIL do not recognize tumour antigens2, and little is known about transcriptional programs of MANA-specific TIL. Here, we identify MANA-specific T cell clones using the MANA functional expansion of specific T cells assay3 in neoadjuvant anti-PD-1-treated non-small cell lung cancers (NSCLC). We use their T cell receptors as a 'barcode' to track and analyse their transcriptional programs in the tumour microenvironment using coupled single-cell RNA sequencing and T cell receptor sequencing. We find both MANA- and virus-specific clones in TIL, regardless of response, and MANA-, influenza- and Epstein-Barr virus-specific TIL each have unique transcriptional programs. Despite exposure to cognate antigen, MANA-specific TIL express an incompletely activated cytolytic program. MANA-specific CD8 T cells have hallmark transcriptional programs of tissue-resident memory (TRM) cells, but low levels of interleukin-7 receptor (IL-7R) and are functionally less responsive to interleukin-7 (IL-7) compared with influenza-specific TRM cells. Compared with those from responding tumours, MANA-specific clones from non-responding tumours express T cell receptors with markedly lower ligand-dependent signalling, are largely confined to HOBIThigh TRM subsets, and coordinately upregulate checkpoints, killer inhibitory receptors and inhibitors of T cell activation. These findings provide important insights for overcoming resistance to PD-1 blockade.

ABSTRACT The rapid development of single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) technology, with increased sparsity compared to bulk RNA-sequencing (RNA-seq), has led to the emergence of many methods for preprocessing, including imputation methods. Here, we systematically evaluate the performance of 18 state-of-the-art scRNA-seq imputation methods using cell line and tissue data measured across experimental protocols. Specifically, we assess the similarity of imputed cell profiles to bulk samples as well as investigate whether methods recover relevant biological signals or introduce spurious noise in three downstream analyses: differential expression, unsupervised clustering, and inferring pseudotemporal trajectories. Broadly, we found significant variability in the performance of the methods across evaluation settings. While most scRNA-seq imputation methods recover biological expression observed in bulk RNA-seq data, the majority of the methods do not improve performance in downstream analyses compared to no imputation, in particular for clustering and trajectory analysis, and thus should be used with caution. Furthermore, we find that the performance of scRNA-seq imputation methods depends on many factors including the experimental protocol, the sparsity of the data, the number of cells in the dataset, and the magnitude of the effect sizes. We summarize our results and provide a key set of recommendations for users and investigators to navigate the current space of scRNA-seq imputation methods.

Pseudotime analysis with single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) data has been widely used to study dynamic gene regulatory programs along continuous biological processes. While many computational methods have been developed to infer the pseudo-temporal trajectories of cells within a biological sample, methods that compare pseudo-temporal patterns with multiple samples (or replicates) across different experimental conditions are lacking. Lamian is a comprehensive and statistically-rigorous computational framework for differential multi-sample pseudotime analysis. It can be used to identify changes in a biological process associated with sample covariates, such as different biological conditions, and also to detect changes in gene expression, cell density, and topology of a pseudotemporal trajectory. Unlike existing methods that ignore sample variability, Lamian draws statistical inference after accounting for cross-sample variability and hence substantially reduces sample-specific false discoveries that are not generalizable to new samples. Using both simulations and real scRNA-seq data, including an analysis of differential immune response programs between COVID-19 patients with different disease severity levels, we demonstrate the advantages of Lamian in decoding cellular gene expression programs in continuous biological processes.

Regulatory T cells (Treg) are conventionally viewed as suppressors of endogenous and therapy-induced antitumor immunity; however, their role in modulating responses to immune checkpoint blockade (ICB) is unclear. In this study, we integrated single-cell RNA-seq/T cell receptor sequencing (TCRseq) of >73,000 tumor-infiltrating Treg (TIL-Treg) from anti-PD-1-treated and treatment-naive non-small cell lung cancers (NSCLC) with single-cell analysis of tumor-associated antigen (TAA)-specific Treg derived from a murine tumor model. We identified 10 subsets of human TIL-Treg, most of which have high concordance with murine TIL-Treg subsets. Only one subset selectively expresses high levels of TNFRSF4 (OX40) and TNFRSF18 (GITR), whose engangement by cognate ligand mediated proliferative programs and NF-κB activation, as well as multiple genes involved in Treg suppression, including LAG3. Functionally, the OX40hiGITRhi subset is the most highly suppressive ex vivo, and its higher representation among total TIL-Treg correlated with resistance to PD-1 blockade. Unexpectedly, in the murine tumor model, we found that virtually all TIL-Treg-expressing T cell receptors that are specific for TAA fully develop a distinct TH1-like signature over a 2-week period after entry into the tumor, down-regulating FoxP3 and up-regulating expression of TBX21 (Tbet), IFNG, and certain proinflammatory granzymes. Transfer learning of a gene score from the murine TAA-specific TH1-like Treg subset to the human single-cell dataset revealed a highly analogous subcluster that was enriched in anti-PD-1-responding tumors. These findings demonstrate that TIL-Treg partition into multiple distinct transcriptionally defined subsets with potentially opposing effects on ICB-induced antitumor immunity and suggest that TAA-specific TIL-Treg may positively contribute to antitumor responses.

Abstract When analyzing data from in situ RNA detection technologies, cell segmentation is an essential step in identifying cell boundaries, assigning RNA reads to cells, and studying the gene expression and morphological features of cells. We developed a deep-learning-based method, GeneSegNet, that integrates both gene expression and imaging information to perform cell segmentation. GeneSegNet also employs a recursive training strategy to deal with noisy training labels. We show that GeneSegNet significantly improves cell segmentation performances over existing methods that either ignore gene expression information or underutilize imaging information.

We demonstrate that GPT-4V(ision), a large multimodal model, exhibits strong one-shot learning ability, generalizability, and natural language interpretability in various biomedical image classification tasks, including classifying cell types, tissues, cell states, and disease status. Such features resemble human-like performance and distinguish GPT-4V from conventional image classification methods, which typically require large cohorts of training data and lack interpretability.

Abstract It is known that many driver nodes are required to control complex biological networks. Previous studies imply that O ( N ) driver nodes are required in both linear complex network and Boolean network models with N nodes if an arbitrary state is specified as the target. In this paper, we mathematically prove under a reasonable assumption that the expected number of driver nodes is only O (log 2 N + log 2 M ) for controlling Boolean networks if the targets are restricted to attractors, where M is the number of attractors. Since it is expected that M is not very large in many practical networks, this is a significant improvement. This result is based on discovery of novel relationships between control problems on Boolean networks and the coupon collector’s problem, a well-known concept in combinatorics. We also provide lower bounds of the number of driver nodes as well as simulation results using artificial and realistic network data, which support our theoretical findings.

Abstract The diversity of genetic programs and cellular plasticity of glioma-associated myeloid cells, and thus their contribution to tumor growth and immune evasion, is poorly understood. We performed single cell RNA-sequencing of immune and tumor cells from 33 glioma patients of varying tumor grades. We identified two populations characteristic of myeloid derived suppressor cells (MDSC), unique to glioblastoma (GBM) and absent in grades II and III tumors: i) an early progenitor population (E-MDSC) characterized by strong upregulation of multiple catabolic, anabolic, oxidative stress, and hypoxia pathways typically observed within tumor cells themselves, and ii) a monocytic MDSC (M-MDSC) population. The E-MDSCs geographically co-localize with a subset of highly metabolic glioma stem-like tumor cells with a mesenchymal program in the pseudopalisading region, a pathognomonic feature of GBMs associated with poor prognosis. Ligand-receptor interaction analysis revealed symbiotic cross-talk between the stemlike tumor cells and E-MDSCs in GBM, whereby glioma stem cells produce chemokines attracting E-MDSCs, which in turn produce growth and survival factors for the tumor cells. Our large-scale single-cell analysis elucidated unique MDSC populations as key facilitators of GBM progression and mediators of tumor immunosuppression, suggesting that targeting these specific myeloid compartments, including their metabolic programs, may be a promising therapeutic intervention in this deadly cancer. One-Sentence Summary Aggressive glioblastoma harbors two unique myeloid populations capable of promoting stem-like properties of tumor cells and suppressing T cell function in the tumor microenvironment.

Abstract Summary In the exploratory data analysis of single-cell or spatial genomic data, single cells or spatial spots are often visualized using a two-dimensional plot where cell clusters or spot clusters are marked with different colors. With tens of clusters, current visualization methods often assigns visually similar colors to spatially neighboring clusters, making it hard to identify the distinction between clusters. To address this issue, we developed Palo that optimizes the color palette assignment for single-cell and spatial data in a spatially-aware manner. Palo identifies pairs of clusters that are spatially neighboring to each other and assigns visually distinct colors to those neighboring pairs. We demonstrate that Palo leads to improved visualization in real single-cell and spatial genomic datasets. Availability Palo R package is freely available at https://github.com/Winnie09/Palo . Contact zhicheng.ji@duke.edu

Abstract Regulatory T cells (T reg ) are conventionally viewed to suppress endogenous and therapyinduced anti-tumor immunity; however, their role in modulating responses to immune checkpoint blockade (ICB) is unclear. In this study, we integrated single-cell RNAseq/TCRseq of >73,000 tumor-infiltrating T reg (TIL-T reg ) from anti-PD-1-treated and treatment naive non-small cell lung cancers (NSCLC) with single cell analysis of tumor-associated antigen (TAA)-specific T reg derived from a murine tumor model. We identified 10 subsets of human TIL-T reg , most of which have high concordance with murine TIL-T reg subsets. Notably, one subset selectively expresses high levels of OX40 and GITR, whose engangement by cognate ligand mediated proliferative programs and NF-kB activation, as well as multiple genes involved in T reg suppression, in particular LAG3. Functionally, the OX40 hi GITR hi subset in the most highly suppressive ex vivo and T reg expression of OX40, GITR and LAG3, correlated with resistance to PD-1 blockade. Surprisingly, in the murine tumor model, we found that virtually all TIL-T reg expressing T cell receptors that are specific for TAA fully develop a distinct Th1-like signature over a two-week period after entry into the tumor, down-regulating FoxP3 and up-regulating expression of TBX21 ( Tbet), IFNγ and certain pro-inflammatory granzymes. Application of a gene score from the murine TAA-specific Th1-like T reg subset to the human single-cell dataset revealed a highly analogous subcluster that was enriched in anti-PD-1 responding tumors. These findings demonstrate that TIL-T reg partition into multiple distinct transcriptionally-defined subsets with potentially opposing effects on ICB-induced anti-tumor immunity and suggest that TAA-specific TIL-T reg may positively contribute to anti-tumor responses. One-Sentence Summary We define 10 subsets of lung cancer-infiltrating regulatory T cells, one of which is highly suppressive and enriched in anti-PD-1 non-responders and the other is Th1-like and is enriched in PD-1 responders.