Abstract Unusually low temperatures caused by global climate change adversely affect rice production. Sensing cold to trigger signal network is a key base for improvement of chilling tolerance trait. Here, we report that Oryza sativa Calreticulin 3 (OsCRT3) localized at the endoplasmic reticulum (ER) exhibits conformational changes under cold stress, thereby enhancing its interaction with CBL‐interacting protein kinase 7 (OsCIPK7) to sense cold. Phenotypic analyses of OsCRT3 knock‐out mutants and transgenic overexpression lines demonstrate that OsCRT3 is a positive regulator in chilling tolerance. OsCRT3 localizes at the ER and mediates increases in cytosolic calcium levels under cold stress. Notably, cold stress triggers secondary structural changes of OsCRT3 and enhances its binding affinity with OsCIPK7, which finally boosts its kinase activity. Moreover, Calcineurin B‐like protein 7 (OsCBL7) and OsCBL8 interact with OsCIPK7 specifically on the plasma membrane. Taken together, our results thus identify a cold‐sensing mechanism that simultaneously conveys cold‐induced protein conformational change, enhances kinase activity, and Ca 2+ signal generation to facilitate chilling tolerance in rice.

Abstract The entorhinal cortex is involved in establishing enduring visuo-auditory associative memory in the neocortex. Here we explored the mechanisms underlying this synaptic plasticity related to projections from the visual and entorhinal cortices to the auditory cortex, using optogenetics of dual pathways. High-frequency laser stimulation (HFLS) of the visuo-auditory projection did not induce long-term potentiation (LTP). However, after pairing with sound stimulus, the visuo-auditory inputs were potentiated following either infusion of cholecystokinin (CCK) or HFLS of the entorhino-auditory CCK-expressing projection. Combining retrograde tracing and RNAscope in situ hybridization, we show that CCK expression is higher in entorhinal cortex neurons projecting to the auditory cortex than in those originating from the visual cortex. In the presence of CCK, potentiation in the neocortex occurred when the pre-synaptic input arrived 200 ms before post-synaptic firing, even after just five trials of pairing. Behaviorally, inhibition of CCK signaling blocked the generation of associative memory. Our results indicate that neocortical visuo-auditory association is formed through heterosynaptic plasticity, which depends on release of CCK in the neocortex mostly from entorhinal afferents.

Abstract The type VI secretion system (T6SS) is a double-tubular toxin-injection nanomachine widely found in gram-negative human and plant pathogens. The current model depicts that the T6SS spear-like Hcp tube is powered by the contraction of an outer sheath to drill through the envelope of a neighboring cell, achieving cytosol to cytosol delivery. However, gram-positive bacteria seem to be impenetrable to such T6SS action. Here we report that a plant pathogen Acidovorax citrulli (AC) deploys a highly potent T6SS to kill a range of bacteria including Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa , Bacillus subtilis , and Mycobacterium smegmatis as well as fungal species including Candida albicans and Pichia pastoris . Using bioinformatic and biochemical assays, we identified a group of T6SS effectors and characterized one effector RhsB that is critical for interspecies interaction. We report that RhsB contains a conserved YD-repeat domain and a C-terminal nuclease domain. Toxicity of RhsB was neutralized by its downstream immunity proteins through direct interaction. RhsB was cleaved at the C-terminal end and a catalytic mutation within the internal aspartic protease abolished such cleavage. Collectively, the T6SS of AC displays potent activities to penetrate the cell envelope barriers of gram-positive and fungal species, highlighting the greatly expanded capabilities of T6SS in modulating microbiome compositions in complex environments.

Abstract Cholecystokinin (CCK) is an essential modulator for neuroplasticity in sensory and emotional domains. Here, we investigated the role of CCK in motor learning using a single pellet reaching task in mice. Mice with a knockout of cck gene (CCK -/- ) or blockade of CCK-B receptor (CCKBR) showed defective motor learning ability; the success rate of retrieving reward remained at the baseline level compared to the wildtype mice with significantly increased success rate. We observed no long-term potentiation (LTP) upon high-frequency stimulation (HFS) in the motor cortex of CCK -/- mice, indicating a possible association between motor learning deficiency and neuronal plasticity in the motor cortex. In vivo calcium imaging demonstrated that the deficiency of CCK signalling disrupted the refinement of population neuronal activity in the motor cortex during motor skill training. Anatomical tracing revealed direct projections from CCK-expressing neurons in the rhinal cortex to the motor cortex. Inactivating the CCK neurons in the rhinal cortex using chemogenetic methods significantly suppressed motor learning, and intraperitoneal application of CCK4, a tetrapeptide CCK agonist, rescued the motor learning deficits of CCK -/- mice. In summary, our results suggest that CCK, which could be provided from the rhinal cortex, enables neuroplasticity in the motor cortex leading to motor skill learning.

Abstract Antifungal drug tolerance is a response distinct from resistance, in which cells grow slowly above the minimum inhibitory drug concentration (MIC). Here we found that the majority (69.2%) of 133 Candida albicans clinical isolates, including standard lab strain SC5314, exhibited temperature-enhanced tolerance at 37°C and 39°C, and were not tolerant at 30°C. Other isolates were either always tolerant (23.3%) or never tolerant (7.5%) at these three temperatures, suggesting that tolerance requires different physiological processes in different isolates. At supra-MIC fluconazole concentrations (8-128 μg/ml), tolerant colonies emerged rapidly at a frequency of ~10 −3 . In liquid passages over a broader range of fluconazole concentrations (0.25-128 μg/ml), tolerance emerged rapidly (within one passage) at supra-MIC concentrations. By contrast, resistance appeared at sub-MIC concentrations after 5 or more passages. Of 155 adaptors that evolved higher tolerance, all carried one of several recurrent aneuploid chromosomes, often including chromosome R, alone or in combination with other chromosomes. Furthermore, loss of these recurrent aneuploidies was associated with a loss of acquired tolerance, indicating that specific aneuploidies confer fluconazole tolerance. Thus, genetic background and physiology, and the degree of drug stress (above or below the MIC) influence the evolutionary trajectories and dynamics with which antifungal drug resistance or tolerance emerges. Importance Antifungal drug tolerance differs from drug resistance: tolerant cells grow slowly in drug, while resistant cells usually grow well, due to mutations in a few known genes. More than half of Candida albicans clinical isolates have higher tolerance at body temperature than they do at the lower temperatures used for most lab experiments. This implies that different isolates achieve drug tolerance via several cellular processes. When we evolved different strains at a range of high drug concentrations above inhibitory levels, tolerance emerged rapidly and at high frequency (one in 1000 cells) while resistance only appeared later at very low drug concentrations. An extra copy of all or part of chromosome R was associated with tolerance, while point mutations or different aneuploidies were seen with resistance. Thus, genetic background and physiology, temperature, and drug concentration all influence how drug tolerance or resistance evolves.

Abstract Pseudomonas aeruginosa is an important human pathogen that can cause severe wound and lung infections. It employs the type VI secretion system (H1-T6SS) as a molecular weapon to carry out a unique dueling response to deliver toxic effectors to neighboring sister cells or other microbes after sensing an external attack. However, the underlying mechanism for such dueling is not fully understood. Here, we examined the role of all H1-T6SS effectors and VgrG proteins in assembly and signal sensing by ectopic expression, combinatorial deletion and point mutations, and imaging analyses. Expression of effectors targeting the cell wall and membrane resulted in increased H1-T6SS assembly. Deletion of individual effector and vgrG genes had minor- to-moderate effects on H1-T6SS assembly and dueling activities. The dueling response was detectable in the P. aeruginosa mutant lacking all H1-T6SS effector activities. In addition, double deletions of vgrG1a with either vgrG1b or vgrG1c and double deletions of effector genes tse5 and tse6 severely reduced T6SS assembly and dueling activities, suggesting their critical role in T6SS assembly. Collectively, these data highlight the diverse roles of effectors in not only dictating antibacterial functions but also their differential contributions to the assembly of the complex H1-T6SS apparatus.

Abstract Alzheimer’s disease (AD) is the most common neurodegenerative disease. To date, its cause is unclear and there are no effective treatments or preventive measures. Despite there are accumulating evidences for the existence of AD pathological hallmarks in the brain of aging rhesus monkeys, it remains a mainstream notion that monkeys do not develop AD naturally. This is an important issue because it will determine how we use monkeys in AD studies. To settle down this issue, a group (n=10) of aged rhesus monkeys 26 years old or above went through a systematic AD screening procedure in this study. Three of these monkeys showed severe memory impairments (SMI) after evaluated with a classic working memory test. Further behavioral testing revealed that the SMI monkeys also exhibited apathy-like behavior, which is another core AD clinical symptom. In addition to the cognitive deficits, two of the three SMI monkeys developed all of the three AD pathological hallmarks, including neurofibrillary tangles, senile plaques and neuronal loss. According to the diagnostic criteria of human AD, the two SMI monkeys were clearly naturally occurring AD monkeys. These results suggest that AD is not a uniquely human disease and monkeys have great potential for the development of much needed etiological AD models, which are vital for better understanding of developmental process of AD and the base of identification of early diagnostic biomarkers and effective therapeutic targets of AD.

Abstract Rejuvenation, long a quixotic dream, recently became a possibility through exciting new approaches to counteract aging. For example, parabiosis and partial reprogramming through overexpressing four stem cell transcription factors (Yamanaka factors) both rejuvenate organisms and cells 1–5 . We hypothesize there are many other genetic solutions to human cell rejuvenation, and some solutions may be safer and more potent than current gene targets. We set out to develop a systematic approach to identify novel genes that, when overexpressed or repressed, reprogram the global gene expression of a cell back to a younger state. Using the Hayflick model of human cell replicative aging, we performed a Perturb-seq screen of 200 transcription factors (TFs) selected through a combination of bioinformatic analysis and literature search. We identified dozens of potentially rejuvenating TFs—those that when overexpressed or repressed in late passage cells reprogrammed global gene expression patterns back to an earlier passage state. We further validated four top TF perturbations through molecular phenotyping of various aging hallmarks. Late passage cells either overexpressing EZH2 or E2F3 or repressing STAT3 or ZFX had more cell division, less senescence, improved proteostasis, and enhanced mitochondrial function. These TF perturbations led to similar downstream gene expression programs. In addition, the rejuvenating effects of these TFs were independent of telomeres. We believe our general approach for identifying rejuvenating factors can be applied to other model systems, and some of the top TF perturbations we discovered will lead to future research in novel, safer rejuvenation therapies.

SUMMARY Most eukaryotic proteins are degraded by the 26S proteasome after modification with a polyubiquitin chain. Substrates lacking unstructured segments cannot be degraded directly and require prior unfolding by the Cdc48 ATPase (p97 or VCP in mammals) in complex with its ubiquitin-binding partner Ufd1-Npl4 (UN). Here, we use purified yeast components to reconstitute Cdc48-dependent degradation of well-folded model substrates by the proteasome. We show that a minimal system consists of the 26S proteasome, the Cdc48-UN ATPase complex, the proteasome cofactor Rad23, and the Cdc48 cofactors Ubx5 and Shp1. Rad23 and Ubx5 stimulate polyubiquitin binding to the 26S proteasome and the Cdc48-UN complex, respectively, allowing these machines to compete for substrates before and after their unfolding. Shp1 stimulates protein unfolding by the Cdc48-UN complex, rather than substrate recruitment. In vivo experiments confirm that many proteins undergo bidirectional substrate shuttling between the 26S proteasome and Cdc48 ATPase before being degraded.

Abstract Prevotella copri and related taxa are widely detected in mammalian gut microbiomes and have been linked with one human enterotype. However, their microevolution and macroevolution among hosts are poorly characterized. In this study, extensively collected marker genes and genomes were analyzed to trace their evolutionary history, host specificity, and biogeographic distribution. Investigations based on 16S rRNA gene, gyrB , and genomes suggested that a multi-specific P. copri -containing lineage (PCL) harbors diverse species in higher primates. Firstly, P. copri is the dominant species of PCL in the human gut and consists of multiple groups exhibiting high genomic divergence and conspicuous but non-strict biogeographic pattern. Most African strains with high genomic divergence from other strains were phylogenetically placed near the species root, indicating the co-evolutionary history of P. copri and Homo sapiens . Secondly, although long-term co-evolution between PCL and higher primates was revealed, sporadic signals of co-speciation and extensive host jumping of PCL members were observed among higher primates. Metagenomic and phylogenetic analyses indicated that P. copri and other PCL species found in captive mammals have been recently transmitted from humans. Thirdly, strong evidence was found on the extensively horizontal transfer of genes (e.g., carbohydrate-active enzyme encoding genes) among sympatric P. copri groups and PCL species in the same primate host. Our study provides panoramic insights into the complex effects of vertical and horizontal transmission, and potential niche adaption on speciation, host, and biogeographical distribution spanning microevolutionary and macroevolutionary history for a certain gut bacterial lineage. Importance Prevotella copri and its related taxa, which we designated as Prevotella copri -containing lineage (PCL) in the present study, are widely detected in guts of human, non-human primates and many captive mammals, showing positive or negative correlation to some human diseases. However, a comprehensive understanding on its microevolutionary (within P. copri ) and macroevolutionary (among PCL members) history across host species and host biogeography is still lacking. According to our analysis based on 16S rRNA gene, gyrB and genomes, we provided the panoramic insights into the putative effects of vertical transfer, horizontal transmission and potential niche selection on host and biogeographical distribution of this gut bacterial lineage and P. copri . To our knowledge, it is the first time that a gut bacterial lineage was studied at both micro- and macroevolutionary levels, which can aid our systematic understanding on the host-microbe co-evolutionary interactions.