SUMMARY The meninges of the brain are an important component of neuroinflammatory response. Diverse immune cells move from the calvaria marrow into the dura mater via recently discovered skull-meninges connections (SMCs). However, how the calvaria bone marrow is different from the other bones and whether and how it contributes to human diseases remain unknown. Using multi-omics approaches and whole mouse transparency we reveal that bone marrow cells are highly heterogeneous across the mouse body. The calvaria harbors the most distinct molecular signature with hundreds of differentially expressed genes and proteins. Acute brain injury induces skull-specific alterations including increased calvaria cell numbers. Moreover, TSPO-positron-emission-tomography imaging of stroke, multiple sclerosis and neurodegenerative disease patients demonstrate disease-associated uptake patterns in the human skull, mirroring the underlying brain inflammation. Our study indicates that the calvaria is more than a physical barrier, and its immune cells may present new ways to control brain pathologies. Graphical Abstract Highlights Bone marrow across the mouse body display heterogeneity in their molecular profile Calvaria cells have a distinct profile that is relevant to brain pathologies Brain native proteins are identified in calvaria in pathological states TSPO-PET imaging of the human skull can be a proxy of neuroinflammation in the brain Supplementary Videos can be seen at: http://discotechnologies.org/Calvaria/

Coronavirus disease 2019 (COVID-19), caused by the severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2 (SARS-CoV-2), has been associated mainly with a range of neurological symptoms, including brain fog and brain tissue loss, raising concerns about the virus's acute and potential chronic impact on the central nervous system. In this study, we utilized mouse models and human post-mortem tissues to investigate the presence and distribution of the SARS-CoV-2 spike protein in the skull-meninges-brain axis. Our results revealed the accumulation of the spike protein in the skull marrow, brain meninges, and brain parenchyma. The injection of the spike protein alone caused cell death in the brain, highlighting a direct effect on brain tissue. Furthermore, we observed the presence of spike protein in the skull of deceased long after their COVID-19 infection, suggesting that the spike's persistence may contribute to long-term neurological symptoms. The spike protein was associated with neutrophil-related pathways and dysregulation of the proteins involved in the PI3K-AKT as well as complement and coagulation pathway. Overall, our findings suggest that SARS-CoV-2 spike protein trafficking from CNS borders into the brain parenchyma and identified differentially regulated pathways may present insights into mechanisms underlying immediate and long-term consequences of SARS-CoV-2 and present diagnostic and therapeutic opportunities.

ABSTRACT Targeting nanoparticle therapeutics with cellular accuracy in whole organisms could open breakthrough opportunities in precision medicine. However, evaluating and fine-tuning the biodistribution of such systems in the whole organism at the cellular level remains a major obstacle. Here, we constructed targetable DNA origami, and analyzed biodistribution in transparent mice, in addition to studying tolerability, clearance kinetics, and immune response parameters. Untargeted DNA origami primarily accumulated in the spleen and the liver, while an immune cell-targeting variant successfully attached to immune cells throughout the body. A cancer cell-targeting mimetic co-localized on solid-tumor metastasis in the liver and the lung. These findings indicate that DNA origami can be directed in vivo, providing an important proof-of-concept and highlights the potential of high-resolution tissue-clearing imaging technologies in their development. Graphical Abstract Highlights This study demonstrates the potential of DNA origami-based drug delivery systems as versatile tool for for targeted delivery, which could be used to treat a range of diseases with applications. The immune compatibility, half-life, targeting efficiency, and the biodistribution evaluation of DNA origami indicate its potential for systemic drug delivery. Our approach enables the assessment of biodistribution of nanoparticles in the intact body with a sensitivity to the single-cell level, highlighting the high-resolution tissue clearing technoloies in revealing DNA origami’s feasibility for drug targeting.

Analysis of entire transparent rodent bodies could provide holistic information on biological systems in health and disease. However, it has been challenging to reliably image and quantify signal from endogenously expressed fluorescent proteins in large cleared mouse bodies due to the low signal contrast. Here, we devised a pressure driven, nanobody based whole-body immunolabeling technology to enhance the signal of fluorescent proteins by up to two orders of magnitude. This allowed us to image subcellular details in transparent mouse bodies through bones and highly autofluorescent tissues, and perform quantifications. We visualized for the first-time whole-body neuronal connectivity of an entire adult mouse and discovered that brain trauma induces degeneration of peripheral axons. We also imaged meningeal lymphatic vessels and immune cells through the intact skull and vertebra in naive animals and trauma models. Thus, our new approach can provide an unbiased holistic view of biological events affecting the nervous system and the rest of the body.

Optical tissue transparency permits cellular and molecular investigation of complex tissues in 3D, a fundamental need in biomedical sciences. Adult human organs are particularly challenging for this approach, owing to the accumulation of dense and sturdy molecules in decades-aged human tissues. Here, we introduce SHANEL method utilizing a new tissue permeabilization approach to clear and label stiff human organs. We used SHANEL to generate the first intact transparent adult human brain and kidney, and perform 3D histology using antibodies and dyes in centimeters depth. Thereby, we revealed structural details of the sclera, iris and suspensory ligament in the human eye, and the vessels and glomeruli in the human kidney. We also applied SHANEL on transgenic pig organs to map complex structures of EGFP expressing beta cells in >10 cm size pancreas. Overall, SHANEL is a robust and unbiased technology to chart the cellular and molecular architecture of intact large mammalian organs.

ABSTRACT Although numerous epilepsy-related genes have been identified by unbiased genome-wide screening based on samples from both animal models and patients, the druggable targets for temporal lobe epilepsy (TLE) are still limited. Meanwhile, a large number of candidate genes that might promote or inhibit seizure activities are waiting for further validation. In this study, we first analyzed two public databases and determined the significant down-regulations of two M-type potassium channel genes (KCNQ2/3) expressions in hippocampus samples from TLE patients. Then we reproduced the similar pathological changes in the pilocarpine mouse model of TLE and further detected the decrease of spike frequency adaptation driven by impacted M-currents on dentate gyrus granule neurons. Finally, we employed a small-scale simulation of dentate gyrus network to investigate potential functional consequences of disrupted neuronal excitability. We demonstrated that the impacted spike frequency adaptation of granule cells facilitated the epileptiform activity among the entire network, including prolonged seizure duration and reduced interictal intervals. Our results identify a new mechanism contributing to ictogenesis in TLE and suggest a novel target for the anti-epileptic drug discovery.