Analysis of entire transparent rodent bodies after clearing could provide holistic biological information in health and disease, but reliable imaging and quantification of fluorescent protein signals deep inside the tissues has remained a challenge. Here, we developed vDISCO, a pressure-driven, nanobody-based whole-body immunolabeling technology to enhance the signal of fluorescent proteins by up to two orders of magnitude. This allowed us to image and quantify subcellular details through bones, skin and highly autofluorescent tissues of intact transparent mice. For the first time, we visualized whole-body neuronal projections in adult mice. We assessed CNS trauma effects in the whole body and found degeneration of peripheral nerve terminals in the torso. Furthermore, vDISCO revealed short vascular connections between skull marrow and brain meninges, which were filled with immune cells upon stroke. Thus, our new approach enables unbiased comprehensive studies of the interactions between the nervous system and the rest of the body. A nanobody-based immunolabeling method, vDISCO, boosts the signal of fluorescent proteins and allows imaging of subcellular details in intact transparent mice. It uncovers neuronal projections and skull–meninges connections in whole adult mice.

SUMMARY The meninges of the brain are an important component of neuroinflammatory response. Diverse immune cells move from the calvaria marrow into the dura mater via recently discovered skull-meninges connections (SMCs). However, how the calvaria bone marrow is different from the other bones and whether and how it contributes to human diseases remain unknown. Using multi-omics approaches and whole mouse transparency we reveal that bone marrow cells are highly heterogeneous across the mouse body. The calvaria harbors the most distinct molecular signature with hundreds of differentially expressed genes and proteins. Acute brain injury induces skull-specific alterations including increased calvaria cell numbers. Moreover, TSPO-positron-emission-tomography imaging of stroke, multiple sclerosis and neurodegenerative disease patients demonstrate disease-associated uptake patterns in the human skull, mirroring the underlying brain inflammation. Our study indicates that the calvaria is more than a physical barrier, and its immune cells may present new ways to control brain pathologies. Graphical Abstract Highlights Bone marrow across the mouse body display heterogeneity in their molecular profile Calvaria cells have a distinct profile that is relevant to brain pathologies Brain native proteins are identified in calvaria in pathological states TSPO-PET imaging of the human skull can be a proxy of neuroinflammation in the brain Supplementary Videos can be seen at: http://discotechnologies.org/Calvaria/

SUMMARY Spatial molecular profiling of complex tissues is essential to investigate cellular function in physiological and pathological states. However, methods for molecular analysis of biological specimens imaged in 3D as a whole are lacking. Here, we present DISCO-MS, a technology combining whole-organ imaging, deep learning-based image analysis, and ultra-high sensitivity mass spectrometry. DISCO-MS yielded qualitative and quantitative proteomics data indistinguishable from uncleared samples in both rodent and human tissues. Using DISCO-MS, we investigated microglia activation locally along axonal tracts after brain injury and revealed known and novel biomarkers. Furthermore, we identified initial individual amyloid-beta plaques in the brains of a young familial Alzheimer’s disease mouse model, characterized the core proteome of these aggregates, and highlighted their compositional heterogeneity. Thus, DISCO-MS enables quantitative, unbiased proteome analysis of target tissues following unbiased imaging of entire organs, providing new diagnostic and therapeutic opportunities for complex diseases, including neurodegeneration. Graphical Abstract Highlights DISCO-MS combines tissue clearing, whole-organ imaging, deep learning-based image analysis, and ultra-high sensitivity mass spectrometry DISCO-MS yielded qualitative and quantitative proteomics data indistinguishable from fresh tissues DISCO-MS enables identification of rare pathological regions & their subsequent molecular analysis DISCO-MS revealed core proteome of plaques in 6 weeks old Alzheimer‘s disease mouse model Supplementary Video can be seen at: http://discotechnologies.org/DISCO-MS/

Many diseases, such as obesity, have systemic effects that impact multiple organ systems throughout the body. However, tools for comprehensive, high-resolution analysis of disease-associated changes at the whole-body scale have been lacking. Here, we developed a suite of deep learning-based image analysis algorithms (MouseMapper) and integrated it with tissue clearing and light-sheet microscopy to enable a comprehensive analysis of diseases impacting diverse systems across the mouse body. This approach enables the quantitative analysis of cellular and structural changes across the entire mouse body at unprecedented resolution and scale, including tracking nerves over several centimeters in whole animal bodies. To demonstrate its power, we applied MouseMapper to study nervous and immune systems in high-fat diet induced obesity. We uncovered widespread changes in both immune cell distribution and nerve structures, including alterations in the trigeminal nerve characterized by a reduced number of nerve endings in obese mice. These structural abnormalities were associated with functional deficits of whisker sensing and proteomic changes in the trigeminal ganglion, primarily affecting pathways related to axon growth and the complement system. Additionally, we found heterogeneity in obesity-induced whole-body inflammation across different tissues and organs. Our study demonstrates MouseMapper's capability to discover and quantify pathological alterations at the whole-body level, offering a powerful approach for investigating the systemic impacts of various diseases.

ABSTRACT Targeting nanoparticle therapeutics with cellular accuracy in whole organisms could open breakthrough opportunities in precision medicine. However, evaluating and fine-tuning the biodistribution of such systems in the whole organism at the cellular level remains a major obstacle. Here, we constructed targetable DNA origami, and analyzed biodistribution in transparent mice, in addition to studying tolerability, clearance kinetics, and immune response parameters. Untargeted DNA origami primarily accumulated in the spleen and the liver, while an immune cell-targeting variant successfully attached to immune cells throughout the body. A cancer cell-targeting mimetic co-localized on solid-tumor metastasis in the liver and the lung. These findings indicate that DNA origami can be directed in vivo, providing an important proof-of-concept and highlights the potential of high-resolution tissue-clearing imaging technologies in their development. Graphical Abstract Highlights This study demonstrates the potential of DNA origami-based drug delivery systems as versatile tool for for targeted delivery, which could be used to treat a range of diseases with applications. The immune compatibility, half-life, targeting efficiency, and the biodistribution evaluation of DNA origami indicate its potential for systemic drug delivery. Our approach enables the assessment of biodistribution of nanoparticles in the intact body with a sensitivity to the single-cell level, highlighting the high-resolution tissue clearing technoloies in revealing DNA origami’s feasibility for drug targeting.

Coronavirus disease 2019 (COVID-19), caused by the severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2 (SARS-CoV-2), has been associated mainly with a range of neurological symptoms, including brain fog and brain tissue loss, raising concerns about the virus's acute and potential chronic impact on the central nervous system. In this study, we utilized mouse models and human post-mortem tissues to investigate the presence and distribution of the SARS-CoV-2 spike protein in the skull-meninges-brain axis. Our results revealed the accumulation of the spike protein in the skull marrow, brain meninges, and brain parenchyma. The injection of the spike protein alone caused cell death in the brain, highlighting a direct effect on brain tissue. Furthermore, we observed the presence of spike protein in the skull of deceased long after their COVID-19 infection, suggesting that the spike's persistence may contribute to long-term neurological symptoms. The spike protein was associated with neutrophil-related pathways and dysregulation of the proteins involved in the PI3K-AKT as well as complement and coagulation pathway. Overall, our findings suggest that SARS-CoV-2 spike protein trafficking from CNS borders into the brain parenchyma and identified differentially regulated pathways may present insights into mechanisms underlying immediate and long-term consequences of SARS-CoV-2 and present diagnostic and therapeutic opportunities.

Analysis of entire transparent rodent bodies could provide holistic information on biological systems in health and disease. However, it has been challenging to reliably image and quantify signal from endogenously expressed fluorescent proteins in large cleared mouse bodies due to the low signal contrast. Here, we devised a pressure driven, nanobody based whole-body immunolabeling technology to enhance the signal of fluorescent proteins by up to two orders of magnitude. This allowed us to image subcellular details in transparent mouse bodies through bones and highly autofluorescent tissues, and perform quantifications. We visualized for the first-time whole-body neuronal connectivity of an entire adult mouse and discovered that brain trauma induces degeneration of peripheral axons. We also imaged meningeal lymphatic vessels and immune cells through the intact skull and vertebra in naive animals and trauma models. Thus, our new approach can provide an unbiased holistic view of biological events affecting the nervous system and the rest of the body.