This work presents a thorough characterization of Helaina recombinant human lactoferrin (rhLF, Effera™) expressed in a yeast system at an industrial scale for the first time. Proteomic analysis confirmed that its amino acid sequence is identical to that of native human LF. N-linked glycans were detected at three known glycosylation sites, namely, Asparagines-156, -497, and -642 and they were predominantly oligomannose structures having five to nine mannoses. Helaina rhLF's protein secondary structure was nearly identical to that of human milk lactoferrin (hmLF), as revealed by microfluidic modulation spectroscopy. Results of small-angle X-ray scattering (SAXS) and analytical ultracentrifugation analyses confirmed that, like hmLF, Helaina rhLF displayed well-folded globular structures in solution. Reconstructed solvent envelopes of Helaina rhLF, obtained through the SAXS analysis, demonstrated a remarkable fit with the reported crystalline structure of iron-bound native hmLF. Differential scanning calorimetry investigations into the thermal stability of Helaina rhLF revealed two distinct denaturation temperatures at 68.7 ± 0.9 °C and 91.9 ± 0.5 °C, consistently mirroring denaturation temperatures observed for apo- and holo-hmLF. Overall, Helaina rhLF differed from hmLF in the N-glycans they possessed; nevertheless, the characterization results affirmed that Helaina rhLF was of high purity and exhibited globular structures closely akin to that of hmLF.

ABSTRACT In nucleosomes, histone N-terminal tails exist in dynamic equilibrium between free/accessible and collapsed/DNA-bound states. The latter state is expected to impact histone N-termini availability to the epigenetic machinery. Notably, H3 tail acetylation ( e.g. , K9ac, K14ac, K18ac) is linked to increased H3K4me3 engagement by the BPTF PHD finger, but it is unknown if this mechanism has broader extension. Here we show that H3 tail acetylation promotes nucleosomal accessibility to other H3K4 methyl readers, and importantly, extends to H3K4 writers, notably methyltransferase MLL1. This regulation is not observed on peptide substrates yet occurs on the cis H3 tail, as determined with fully-defined heterotypic nucleosomes. In vivo , H3 tail acetylation is directly and dynamically coupled with cis H3K4 methylation levels. Together, these observations reveal an acetylation ‘chromatin switch’ on the H3 tail that modulates read-write accessibility in nucleosomes and resolve the long-standing question of why H3K4me3 levels are coupled with H3 acetylation.

ABSTRACT We performed a thorough analysis and characterization of multiple batches of Helaina recombinant human lactoferrin (rhLF, Effera™) expressed at an industrial scale in a yeast system. Bottom-up LC-MS/MS-based proteomics analysis detected the full sequence of Helaina rhLF protein and confirmed that its amino acid sequence is identical to that of native human LF (Uniprot i.d. P02788). Helaina rhLF had a protein purity of 98% or higher as determined by three orthogonal methods; reversed-phase HPLC, SDS-PAGE, and LC-MS proteomics analysis. N-linked glycans were detected at three known glycosylation sites, namely, Asparagines-156, -497, and -642. The identified N-glycans of Helaina rhLF were predominantly oligomannose structures with five to nine mannoses (M5-M9), which we also report to be present in both the native human and bovine LF. human milk LF (hmLF) possessed lower levels of oligomannose structures and were mainly M5 and M6. Helaina rhLF protein secondary structure was nearly identical to that of hmLF, as revealed by microfluidic modulation spectroscopy. Results of small-angle X-ray scattering (SAXS) and analytical ultracentrifugation analyses confirmed that, like hmLF, Helaina rhLF displayed well-folded globular structures in solution. Reconstructed solvent envelopes of Helaina rhLF, obtained through the SAXS analysis, demonstrated a remarkable fit with the reported crystalline structure of iron-bound native hmLF. Differential scanning calorimetry investigations into the thermal stability of Helaina rhLF revealed two distinct denaturation temperatures at 68.7±0.9 °C and 91.9±0.5 °C, consistently mirroring denaturation temperatures observed for apo-and holo-hmLF. Overall, the characterization analysis results affirmed that Helaina rhLF was of high purity and exhibited globular structures closely akin to that of hmLF.

The enzymes that regulate histone H3 lysine 4 (H3K4) methylation are required for cellular differentiation and development and are often mutated in human disease. Mixed Lineage Leukemia protein-1 (MLL1) is a member of the SET1 family of histone H3 lysine 4 methyltransferases, which require interaction with a conserved sub-complex consisting of WDR5, RbBP5, Ash2L and DPY30 (WRAD2) for maximal activity. It is currently unclear how assembly of SET1 family complexes is involved in the spatiotemporal control of H3K4 methylation in eukaryotic genomes. In this investigation, we systematically characterized the hydrodynamic and kinetic properties of a reconstituted human MLL1 core complex and found that its assembly is highly concentration and temperature dependent. Consistent with a hierarchical assembly pathway, we found that the holo-complex assembles through interactions between the MW and RAD2 sub-complexes, which is correlated with enzymatic activity. Surprisingly, we found that the disassembled state is favored at physiological temperatures, and that this thermodynamic barrier can be overcome under conditions that induce high-local concentrations of subunits in phase separated compartments. Combining this data with the observation that MLL1 primary sequence contains large regions of intrinsic disorder, we propose a swinging-domain model in which the interaction between a tethered MW subcomplex and multiple nucleosome-RAD2 complexes is regulated by the rapid formation or dissolution of biomolecular condensates, such as occurs in transcription factories. This model provides an elegant switch-like mechanism for spatiotemporal control of H3K4 methylation within eukaryotic genomes.