Abstract Intrinsically disordered regions (IDRs) are essential for membrane receptor regulation but often remain unresolved in structural studies. TRPV4, a member of the TRP vanilloid channel family involved in thermo- and osmosensation, has a large N-terminal IDR of approximately 150 amino acids. With an integrated structural biology approach, we analyze the structural ensemble of the TRPV4 IDR and identify a network of regulatory elements that modulate channel activity in a hierarchical lipid-dependent manner through transient long-range interactions. A highly conserved autoinhibitory patch acts as a master regulator by competing with PIP 2 binding to attenuate channel activity. Molecular dynamics simulations show that loss of the interaction between the PIP 2 -binding site and the membrane reduces the force exerted by the IDR on the structured core of TRPV4. This work demonstrates that IDR structural dynamics are coupled to TRPV4 activity and highlights the importance of IDRs for TRP channel function and regulation.

ABSTRACT Gasdermin D (GSDMD) executes inflammatory cell death pyroptosis by permeabilizing the plasma membrane (PM). We introduce polymer-supported PM (PSPM) to gain access to the cytoplasmic side of the PM with imaging techniques while preserving the native PM complexity and lipid microenvironment. By combining PSPM with DNA-PAINT super-resolution microscopy we visualized, for the first time, GSDMD nanostructures directly at the PM of pyroptotic cells. We resolved diverse macromolecular architectures with ring-and arc-shaped GSDMD oligomers that enable PM permeabilization. The pyroptotically-inactive mutant GSDMD-C192A (human C191A) still interacts with the PM however fails to form pores. GSDMD expression levels affect pore density but not permeabilization ability. Finally, we identified the local PI(3,4,5)P 3 concentration as a key regulatory element of PM permeabilization. Increase in PI(3,4,5)P 3 levels in the PM during pyroptosis facilitates growth into large ring-shaped pores. Using molecular dynamics (MD) simulations, we identified the mechanism by which PI(3,4,5)P 3 stabilizes the GSDMD assembly.

Abstract Bioactive peptides are key molecules in health and medicine. Deep learning holds a big promise for the discovery and design of bioactive peptides. Yet, suitable experimental approaches are required to validate candidates in high throughput and at low cost. Here, we established a cell- free protein synthesis (CFPS) pipeline for the rapid and inexpensive production of antimicrobial peptides (AMPs) directly from DNA templates. To validate our platform, we used deep learning to design thousands of AMPs de novo. Using computational methods, we prioritized 500 candidates that we produced and screened with our CFPS pipeline. We identified 30 functional AMPs, which we characterized further through molecular dynamics simulations, antimicrobial activity and toxicity. Notably, six de novo-AMPs feature broad-spectrum activity against multidrug-resistant pathogens and do not develop bacterial resistance. Our work demonstrates the potential of CFPS for production and testing of bioactive peptides within less than 24 hours and <10$ per screen.

Abstract During infection the SARS-CoV-2 virus fuses its viral envelope with cellular membranes of its human host. Initial contact with the host cell and membrane fusion are both mediated by the viral spike (S) protein. Proteolytic cleavage of S at the S2′ site exposes its 40 amino acid long fusion peptide (FP). Binding of the FP to the host membrane anchors the S2 domain of S in both the viral and the host membrane. The reorganization of S2 then pulls the two membranes together. Here we use molecular dynamics (MD) simulations to study the two core functions of the SARS-CoV-2 FP: to attach quickly to cellular membranes and to form an anchor strong enough to withstand the mechanical force during membrane fusion. In eight 10 μ s-long MD simulations of FP in proximity to endosomal and plasma membranes, we find that FP binds spontaneously to the membranes and that binding proceeds predominantly by insertion of two short amphipathic helices into the membrane interface. Connected via a flexible linker, the two helices can bind the membrane independently, yet binding of one promotes the binding of the other by tethering it close to the target membrane. By simulating mechanical pulling forces acting on the C-terminus of the FP we then show that the bound FP can bear forces up to 250 pN before detaching from the membrane. This detachment force is more than ten-fold higher than an estimate of the force required to pull host and viral membranes together for fusion. We identify a fully conserved disulfide bridge in the FP as a major factor for the high mechanical stability of the FP membrane anchor. We conclude, first, that the sequential binding of two short amphipathic helices allows the SARS-CoV-2 FP to insert quickly into the target membrane, before the virion is swept away after shedding the S1 domain connecting it to the host cell receptor. Second, we conclude that the double attachment and the conserved disulfide bridge establish the strong anchoring required for subsequent membrane fusion. Multiple distinct membrane-anchoring elements ensure high avidity and high mechanical strength of FP-membrane binding.

In response to pathogen infection, gasdermin (GSDM) proteins form membrane pores that induce a host cell death process called pyroptosis1-3. Studies of human and mouse GSDM pores reveal the functions and architectures of 24-33 protomers assemblies4-9, but the mechanism and evolutionary origin of membrane targeting and GSDM pore formation remain unknown. Here we determine a structure of a bacterial GSDM (bGSDM) pore and define a conserved mechanism of pore assembly. Engineering a panel of bGSDMs for site-specific proteolytic activation, we demonstrate that diverse bGSDMs form distinct pore sizes that range from smaller mammalian-like assemblies to exceptionally large pores containing >50 protomers. We determine a 3.3 Å cryo-EM structure of a Vitiosangium bGSDM in an active slinky-like oligomeric conformation and analyze bGSDM pores in a native lipid environment to create an atomic-level model of a full 52-mer bGSDM pore. Combining our structural analysis with molecular dynamics simulations and cellular assays, we define a stepwise model of GSDM pore assembly and demonstrate that pore formation is driven by local unfolding of membrane-spanning β-strand regions and pre-insertion of a covalently bound palmitoyl into the target membrane. These results yield insights into the diversity of GSDM pores found in nature and the function of an ancient post-translational modification in enabling a programmed host cell death process.

Abstract Cryo-electron tomography (CryoET) resolves individual macromolecules inside living cells. However, the complex composition and high density of cells challenge the faithful identification of features in tomograms. Here, we capitalize on recent advances in electron tomography and demonstrate that 3D template matching (TM) localizes a wide range of structures inside crowded eukaryotic cells with confidence 10 to 100-fold above the noise level. We establish a TM pipeline with systematically tuned parameters for automated, objective and comprehensive feature identification. High-fidelity and high-confidence localizations of nuclear pore complexes, vaults, ribosomes, proteasomes, lipid membranes and microtubules, and individual subunits, demonstrate that TM is generic. We resolve ∼100-kDa proteins, connect the functional states of complexes to their cellular localization, and capture vaults carrying ribosomal cargo in situ . By capturing individual molecular events inside living cells with defined statistical confidence, high-confidence TM greatly speeds up the CryoET workflow and sets the stage for visual proteomics.

Abstract Gasdermin-D (GSDMD) is the ultimate effector of pyroptosis, a form of programmed cell death associated with pathogen invasion and inflammation. After proteolytic cleavage by caspases activated by the inflammasome, the GSDMD N-terminal domain (GSDMD NT ) assembles on the inner leaflet of the plasma membrane and induces the formation of large membrane pores. We use atomistic molecular dynamics simulations to study GSDMD NT monomers, oligomers, and rings in an asymmetric plasma membrane mimetic. We identify distinct interaction motifs of GSDMD NT with phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PI(4,5)P 2 ) and phosphatidylserine (PS) head-groups and describe differential lipid binding between the pore and prepore conformations. Oligomers are stabilized by shared lipid binding sites between neighboring monomers acting akin to double-sided tape. We show that already small GSDMD NT oligomers form stable, water-filled and ion-conducting membrane pores bounded by curled beta-sheets. In large-scale simulations, we resolve the process of pore formation by lipid detachment from GSDMD NT arcs and lipid efflux from partial rings. We find that that high-order GSDMD NT oligomers can crack under the line tension of 86 pN created by an open membrane edge to form the slit pores or closed GSDMD NT rings seen in experiment. Our simulations provide a detailed view of key steps in GSDMD NT -induced plasma membrane pore formation, including sublytic pores that explain nonselective ion flux during early pyroptosis. Significance Gasdermins execute pyroptotic membrane perforation that is responsible for the release of inflammatory signals and ultimately leads to lytic cell death. They assemble into an approximately 20 nm wide transmembrane β-barrel pore across the plasma membrane. With atomistic molecular simulations of gasdermin-D in a realistic asymmetric plasma membrane mimetic, we show that already small oligomers can form stable water-filled and ionconducting pores. Simulations of larger oligomeric assemblies reveal instabilities in the circular prepore and demonstrate pathways to the formation of slit and ring-shaped pores. Our work gives structural and dynamic insight into how small membrane pores emerge that dissipate the ionic gradient of the cell, but not yet cause cell lysis.