Abstract A central problem in genomics is understanding the effect of individual DNA variants. Multiplexed Assays of Variant Effect (MAVEs) can help address this challenge by measuring all possible single nucleotide variant effects in a gene or regulatory sequence simultaneously. Here we describe MaveDB v2, which has become the database of record for MAVEs. MaveDB now contains a large fraction of published studies, comprising over two hundred datasets and three million variant effect measurements. We created tools and APIs to streamline data submission and access, transforming MaveDB into a hub for the analysis and dissemination of these impactful datasets.

Summary

 Tooth enamel secreted by ameloblasts (AMs) is the hardest material in the human body, acting as a shield to protect the teeth. However, the enamel is gradually damaged or partially lost in over 90% of adults and cannot be regenerated due to a lack of ameloblasts in erupted teeth. Here, we use single-cell combinatorial indexing RNA sequencing (sci-RNA-seq) to establish a spatiotemporal single-cell census for the developing human tooth and identify regulatory mechanisms controlling the differentiation process of human ameloblasts. We identify key signaling pathways involved between the support cells and ameloblasts during fetal development and recapitulate those findings in human ameloblast in vitro differentiation from induced pluripotent stem cells (iPSCs). We furthermore develop a disease model of amelogenesis imperfecta in a three-dimensional (3D) organoid system and show AM maturation to mineralized structure in vivo. These studies pave the way for future regenerative dentistry.

ABSTRACT Determining the pathogenicity of human genetic variants is a critical challenge, and functional assessment is often the only option. Experimentally characterizing millions of possible missense variants in thousands of clinically important genes will likely require generalizable, scalable assays. Here we describe Variant Abundance by Massively Parallel Sequencing (VAMP-seq), which measures the effects of thousands of missense variants of a protein on intracellular abundance in a single experiment. We apply VAMP-seq to quantify the abundance of 7,595 single amino acid variants of two proteins, PTEN and TPMT, in which functional variants are clinically actionable. We identify 1,079 PTEN and 805 TPMT single amino acid variants that result in low protein abundance, and may be pathogenic or alter drug metabolism, respectively. We observe selection for low-abundance PTEN variants in cancer, and our abundance data suggest that a PTEN variant accounting for ~10% of PTEN missense variants in melanomas functions via a dominant negative mechanism. Finally, we demonstrate that VAMP-seq can be applied to other genes, highlighting its potential as a generalizable assay for characterizing missense variants.

Abstract Sex differences and age-related changes in the human heart at the tissue, cell, and molecular level have been well-documented and many may be relevant for cardiovascular disease. However, how molecular programs within individual cell types vary across individuals by age and sex remains poorly characterized. To better understand this variation, we performed single-nucleus combinatorial indexing (sci) ATAC- and RNA-Seq in human heart samples from nine donors. We identify hundreds of differentially expressed genes by age and sex. Sex dependent alterations include pathways such as TGFβ signaling and metabolic shifts by sex, evident in both transcriptional alterations and differing presence of transcription factor (TF) motifs in accessible chromatin. Age was associated with changes such as immune activation-related transcriptional and chromatin accessibility differences, as well as changes in the relative proportion of cardiomyocytes, neurons, and perivascular cells. In addition, we compare our adult-derived ATAC-Seq profiles to analogous fetal cell types to identify putative developmental-stage-specific regulatory factors. Finally, we train predictive models of cell-type-specific RNA expression levels utilizing ATAC-Seq profiles to link distal regulatory sequences to promoters, quantifying the predictive value of a simple TF-to-expression regulatory grammar and identifying cell-type-specific TFs.

Abstract Tooth enamel secreted by ameloblasts is the hardest material in the human body, acting as a shield protecting the teeth. However, the enamel is gradually damaged or partially lost in over 90% of adults and cannot be regenerated due to a lack of ameloblasts in erupted teeth. Here we use sci-RNA-seq to establish a spatiotemporal single-cell atlas for the developing human tooth and identify regulatory mechanisms controlling the differentiation process of human ameloblasts. We reveal key signaling pathways involved between the support cells and ameloblasts during fetal development and recapitulate those findings in a novel human ameloblast in vitro differentiation from iPSCs. We furthermore develop a mineralizing enamel organ-like 3D organoid system. These studies pave the way for future regenerative dentistry and therapies toward genetic diseases affecting enamel formation.

Abstract Introduction While influenza and other respiratory pathogens cause significant morbidity and mortality, the community-based burden of these infections remains incompletely understood. The development of novel methods to detect respiratory infections is essential for mitigating epidemics and developing pandemic-preparedness infrastructure. Methods From October 2019 to March 2020, we conducted a home-based cross-sectional study in the greater Seattle area, utilizing electronic consent and data collection instruments. Participants received nasal swab collection kits via rapid delivery within 24 hours of self-reporting respiratory symptoms. Samples were returned to the laboratory and were screened for 26 respiratory pathogens and a human marker. Participant data were recorded via online survey at the time of sample collection and one week later. Results Of the 4,572 consented participants, 4,359 (95.3%) received a home swab kit, and 3,648 (83.7%) returned a nasal specimen for respiratory pathogen screening. The 3,638 testable samples had a mean RNase P C R T value of 19.0 (SD: 3.4) and 1,232 (33.9%) samples had positive results for one or more pathogens, including 645 (17.7%) influenza-positive specimens. Among the testable samples, the median time between shipment of the home swab kit and completion of laboratory testing was 8 days [IQR: 7.0-14.0]. Discussion Home-based surveillance using online participant enrollment and specimen self-collection is a feasible method for community-level monitoring of influenza and other respiratory pathogens, which can readily be adapted for use during pandemics.

Abstract CRISPR-based gene activation (CRISPRa) is a promising therapeutic approach for gene therapy, upregulating gene expression by targeting promoters or enhancers in a tissue/cell-type specific manner. Here, we describe an experimental framework that combines highly multiplexed perturbations with single-cell RNA sequencing (sc-RNA-seq) to identify cell-type-specific, CRISPRa-responsive cis- regulatory elements and the gene(s) they regulate. Random combinations of many gRNAs are introduced to each of many cells, which are then profiled and partitioned into test and control groups to test for effect(s) of CRISPRa perturbations of both enhancers and promoters on the expression of neighboring genes. Applying this method to candidate cis- regulatory elements in both K562 cells and iPSC-derived excitatory neurons, we identify gRNAs capable of specifically and potently upregulating target genes, including autism spectrum disorder (ASD) and neurodevelopmental disorder (NDD) risk genes. A consistent pattern is that the responsiveness of individual enhancers to CRISPRa is restricted by cell type, implying a dependency on either chromatin landscape and/or additional trans- acting factors for successful gene activation. The approach outlined here may facilitate large-scale screens for gRNAs that activate therapeutically relevant genes in a cell type-specific manner.

Loss-of-function mutations in BRCA1 confer a predisposition to breast and ovarian cancer. Genetic testing for mutations in the BRCA1 gene frequently reveals a missense variant for which the impact on the molecular function of the BRCA1 protein is unknown. Functional BRCA1 is required for homology directed repair (HDR) of double-strand DNA breaks, a key activity for maintaining genome integrity and tumor suppression. Here we describe a multiplex HDR reporter assay to simultaneously measure the effect of hundreds of variants of BRCA1 on its role in DNA repair. Using this assay, we measured the effects of ~1,700 amino acid substitutions in the first 302 residues of BRCA1. Benchmarking these results against variants with known effects, we demonstrate accurate discrimination of loss-of-function versus benign variants. We anticipate that this assay can be used to functionally characterize BRCA1 missense variants at scale, even before the variants are observed in results from genetic testing.

Multiplex Assays of Variant Effect (MAVEs), such as deep mutational scans and massively parallel reporter assays, test thousands of sequence variants in a single experiment. Despite the importance of MAVE data for basic and clinical research, there is no standard resource for their discovery and distribution. Here we present MaveDB, a public repository for large-scale measurements of sequence variant impact, designed for interoperability with applications to interpret these datasets. We also describe the first of these applications, MaveVis, which retrieves, visualizes, and contextualizes variant effect maps. Together, the database and applications will empower the community to mine these powerful datasets.

ABSTRACT Single nucleotide variants are the most frequent type of sequence changes detected in the genome and these are frequently variants of uncertain significance (VUS). VUS are changes in DNA for which disease risk association is unknown. Thus, methods that classify the functional impact of a VUS can be used as evidence for variant interpretation. In the case of the breast and ovarian cancer specific tumor suppressor protein, BRCA1, pathogenic missense variants frequently score as loss of function in an assay for homology-directed repair (HDR) of DNA double-strand breaks. We previously published functional results using a multiplexed assay for 1056 amino acid substitutions residues 2-192 in the amino terminus of BRCA1. In this study, we have re-assessed the data from this multiplexed assay using an improved analysis pipeline. These new analysis methods yield functional scores for more variants in the first 192 amino acids of BRCA1, plus we report new results for BRCA1 amino acid residues 193-302. We now present the functional classification of 2172 BRCA1 variants in BRCA1 residues 2-302 using the multiplexed HDR assay. Comparison of the functional determinations of the missense variants with clinically known benign or pathogenic variants indicated 93% sensitivity and 100% specificity for this assay. The results from BRCA1 variants tested in this assay are a resource for clinical geneticists for evidence to evaluate VUS in BRCA1 . AUTHOR SUMMARY Most missense substitutions in BRCA1 are variants of unknown significance (VUS), and individuals with a VUS in BRCA1 cannot know from genetic information alone whether this variant predisposes to breast or ovarian cancer. We apply a multiplexed functional assay for homology directed repair of DNA double strand breaks to assess variant impact on this important BRCA1 protein function. We analyzed 2172 variants in the amino-terminus of BRCA1 and demonstrate that variants that are known as pathogenic have a loss of function in the DNA repair assay. Conversely, variants that are known to be benign are functionally normal in the multiplexed assay. We suggest that these functional determinations of BRCA1 variants can be used to augment the information that clinical cancer geneticists provide to patients who have a VUS in BRCA1 .