ABSTRACT Fluorescence microscopy relies on dyes that absorb short-wavelength photons and emit longer-wavelength light. In addition to this fluorescence process, dyes can undergo other photochemical reactions that result in spectral shifts and irreversible photobleaching. Increases in brightness, ‘chromostability’, and photostability of fluorescent dyes are therefore crucial for advancing the frontier of bioimaging. Here, we describe a general approach to improve small-molecule fluorophores using deuteration. Incorporating deuterium into the alkylamino substituents of rhodamines and other dyes improves fluorescence quantum yield, inhibits photochemically induced spectral shifts, and slows irreparable photobleaching. These compounds are easily synthesized and show improved performance in cellular imaging experiments.

A bstract Cellular functions are regulated by synthesizing and degrading proteins on time scales ranging from minutes to weeks. Protein turnover varies across proteins, cellular compartments, cell types, and tissues. In the brain, circuit-specific protein turnover is thought to underlie synaptic plasticity, but current methods to track protein turnover lack cellular or subcellular resolution. We describe a pulse–chase method (DELTA) to measure protein turnover with high spatial and temporal resolution throughout the body. DELTA relies on the rapid covalent capture by HaloTag of fluorescent ligands optimized for bioavailability in vivo , overcoming the unique challenges associated with labeling in the brain. We found that the nuclear protein MeCP2 showed brain-region- and cell-type-specific turnover, and the synaptic protein PSD95 was destabilized in specific brain regions following behavioral enrichment. A new variant of expansion microscopy enabled turnover measurements at individual synapses. DELTA will enable studies of adaptive and maladaptive plasticity in brain-wide neural circuits.

Abstract Neurons integrate synaptic inputs within their dendrites and produce spiking outputs, which then propagate down the axon and back into the dendrites where they contribute to plasticity. Mapping the voltage dynamics in dendritic arbors of live animals is crucial for understanding neuronal computation and plasticity rules. Here we combine patterned channelrhodopsin activation with dual-plane structured illumination voltage imaging, for simultaneous perturbation and monitoring of dendritic and somatic voltage in Layer 2/3 pyramidal neurons in anesthetized and awake mice. We examined the integration of synaptic inputs and compared the dynamics of optogenetically evoked, spontaneous, and sensory-evoked back-propagating action potentials (bAPs). Our measurements revealed a broadly shared membrane voltage throughout the dendritic arbor, and few signatures of electrical compartmentalization among synaptic inputs. However, we observed spike rate acceleration-dependent propagation of bAPs into distal dendrites. We propose that this dendritic filtering of bAPs may play a critical role in activity-dependent plasticity.

Summary Chemical synapses between axons and dendrites mediate much of the brain’s intercellular communication. Here we describe a new kind of synapse – the axo-ciliary synapse - between axons and primary cilia. By employing enhanced focused ion beam – scanning electron microscopy on samples with optimally preserved ultrastructure, we discovered synapses between the serotonergic axons arising from the brainstem, and the primary cilia of hippocampal CA1 pyramidal neurons. Functionally, these cilia are enriched in a ciliary-restricted serotonin receptor, 5-hydroxytryptamine receptor 6 (HTR6), whose mutation is associated with learning and memory defects. Using a newly developed cilia-targeted serotonin sensor, we show that optogenetic stimulation of serotonergic axons results in serotonin release onto cilia. Ciliary HTR6 stimulation activates a non-canonical G αq/11 -RhoA pathway. Ablation of this pathway results in nuclear actin and chromatin accessibility changes in CA1 pyramidal neurons. Axo-ciliary synapses serve as a distinct mechanism for neuromodulators to program neuron transcription through privileged access to the nuclear compartment.

Abstract How pioneer factors interface with chromatin to promote accessibility for transcription control is poorly understood in vivo. Here, we directly visualize chromatin association by the prototypical GAGA pioneer factor (GAF) in live Drosophila hemocytes. Single-particle tracking reveals that the majority of GAF is chromatin-bound, with a stable-binding fraction showing nucleosome-like confinement residing on chromatin for over 2 minutes, far longer than the dynamic range of most transcription factors. These kinetic properties require the full complement of GAF’s DNA-binding, multimerization and intrinsically disordered domains, and are autonomous from recruited chromatin remodelers NURF and PBAP, whose activities primarily benefit GAF’s neighbors such as HSF. Evaluation of GAF kinetics together with its endogenous abundance indicates that despite on-off dynamics, GAF constitutively and fully occupies chromatin targets, thereby providing a temporal mechanism that sustains open chromatin for transcriptional responses to homeostatic, environmental, and developmental signals.

The endoplasmic reticulum (ER) and the Golgi apparatus are the first sorting stations along the secretory pathway of mammalian cells and have a crucial role in protein quality control and cellular homeostasis. While machinery components mediating ER-to-Golgi transport have been mapped, it is unclear how exchange between the two closely juxtaposed organelles is coordinated in living cells. Here, using gene editing to tag machinery components, live-cell confocal and stimulated emission depletion (STED) super-resolution microscopy, we show that ER-to-Golgi transport occurs via a dynamic network of tubules positive for the small GTPase ARF4. swCOPI machinery is tightly associated to this network and moves with tubular-vesicular structures. Strikingly, the ARF4 network appears to be continuous with the ER and ARF4 tubules remodel around static ER exit sites (ERES) defined by COPII machinery. We were further able to dissect the steps of ER-to-Golgi transport with functional trafficking assays. A wave of cargo released from the ER percolates through peripheral and Golgi-tethered ARF4 structures before filling the cis-Golgi. Perturbation via acute degradation of ARF4 shows an active regulatory role for the GTPase and COPI in anterograde transport. Our data supports a model in which anterograde ER-to-Golgi transport occurs via an ARF4 tubular-vesicular network directly connecting the ER and Golgi-associated pre-cisternae.

Abstract One-third of the mammalian proteome is comprised of transmembrane and secretory proteins that are synthesized on endoplasmic reticulum (ER). Here, we investigate the spatial distribution and regulation of mRNAs encoding these membrane and secretory proteins (termed “secretome” mRNAs) through live cell, single molecule tracking to directly monitor the position and translation states of secretome mRNAs on ER and their relationship to other organelles. Notably, translation of secretome mRNAs occurred preferentially near lysosomes on ER marked by the ER junction-associated protein, Lunapark. Knockdown of Lunapark reduced the extent of secretome mRNA translation without affecting translation of other mRNAs. Less secretome mRNA translation also occurred when lysosome function was perturbed by raising lysosomal pH or inhibiting lysosomal proteases. Secretome mRNA translation near lysosomes was enhanced during amino acid deprivation. Addition of the integrated stress response inhibitor, ISRIB, reversed the translation inhibition seen in Lunapark knockdown cells, implying an eIF2 dependency. Altogether, these findings uncover a novel coordination between ER and lysosomes, in which local release of amino acids and other factors from ER-associated lysosomes patterns and regulates translation of mRNAs encoding secretory and membrane proteins.

In the nucleus, biological processes are driven by proteins that diffuse through and bind to a meshwork of nucleic acid polymers. To better understand this interplay, we developed an imaging platform to simultaneously visualize single protein dynamics together with the local chromatin environment in live cells. Together with super-resolution imaging, new fluorescent probes, and biophysical modeling, we demonstrated that nucleosomes display differential diffusion and packing arrangements as chromatin density increases whereas the viscoelastic properties and accessibility of the interchromatin space remain constant. Perturbing nuclear functions impacted nucleosome diffusive properties in a manner that was dependent on local chromatin density and supportive of a model wherein transcription locally stabilizes nucleosomes while simultaneously allowing for the free exchange of nuclear proteins. Our results reveal that nuclear heterogeneity arises from both active and passive process and highlights the need to account for different organizational principals when modeling different chromatin environments.

ABSTRACT Conserved ATP-dependent chromatin remodelers establish and maintain genome-wide chromatin architectures of regulatory DNA during cellular lifespan, but the temporal interactions between remodelers and chromatin targets have been obscure. We performed live-cell single-molecule tracking for RSC, SWI/SNF, CHD1, ISW1, ISW2, and INO80 remodeling complexes in budding yeast and detected hyperkinetic behaviors for chromatin-bound molecules that frequently transition to the free state for all complexes. Chromatin-bound remodelers display notably higher diffusion than nucleosomal histones, and strikingly fast dissociation kinetics with 4-7 s mean residence times. These enhanced dynamics require ATP binding or hydrolysis by the catalytic ATPase, uncovering an additional function to its established role in nucleosome remodeling. Kinetic simulations show that multiple remodelers can repeatedly occupy the same promoter region on a timescale of minutes, implicating an unending ‘tug-of-war’ that controls a temporally shifting window of accessibility for the transcription initiation machinery.

Functional imaging using fluorescent indicators has revolutionized biology but additional sensor scaffolds are needed to access properties such as bright, far-red emission. We introduce a new platform for 'chemigenetic' fluorescent indicators, utilizing the self-labeling HaloTag protein conjugated to environmentally sensitive synthetic fluorophores. This approach affords bright, far-red calcium and voltage sensors with highly tunable photophysical and chemical properties, which can reliably detect single action potentials in neurons.