The cyclotides constitute a recently discovered family of plant-derived peptides that have the unusual features of a head-to-tail cyclized backbone and a cystine knot core. These features are thought to contribute to their exceptional stability, as qualitatively observed during experiments aimed at sequencing and characterizing early members of the family. However, to date there has been no quantitative study of the thermal, chemical, or enzymatic stability of the cyclotides. In this study, we demonstrate the stability of the prototypic cyclotide kalata B1 to the chaotropic agents 6 M guanidine hydrochloride (GdHCl) and 8 M urea, to temperatures approaching boiling, to acid, and following incubation with a range of proteases, conditions under which most proteins readily unfold. NMR spectroscopy was used to demonstrate the thermal stability, while fluorescence and circular dichroism were used to monitor the chemical stability. Several variants of kalata B1 were also examined, including kalata B2, which has five amino acid substitutions from B1, two acyclic permutants in which the backbone was broken but the cystine knot was retained, and a two-disulfide bond mutant. Together, these allowed determinations of the relative roles of the cystine knot and the circular backbone on the stability of the cyclotides. Addition of a denaturant to kalata B1 or an acyclic permutant did not cause unfolding, but the two-disulfide derivative was less stable, despite having a similar three-dimensional structure. It appears that the cystine knot is more important than the circular backbone in the chemical stability of the cyclotides. Furthermore, the cystine knot of the cyclotides is more stable than those in similar-sized molecules, judging by a comparison with the conotoxin PVIIA. There was no evidence for enzymatic digestion of native kalata B1 as monitored by LC-MS, but the reduced form was susceptible to proteolysis by trypsin, endoproteinase Glu-C, and thermolysin. Fluorescence spectra of kalata B1 in the presence of dithiothreitol, a reducing agent, showed a marked increase in intensity thought to be due to removal of the quenching effect on the Trp residue by the neighboring Cys5-Cys17 disulfide bond. In general, the reduced peptides were significantly more susceptible to chemical or enzymatic breakdown than the oxidized species.

SUMMARY Wheat-rye 1RS.1BL translocation has a significant impact on wheat yield and hence food production globally. However, the genomic basis of its contributions to wheat improvement is undetermined. Here, we generated a high-quality assembly of 1RS.1BL translocation comprising 748,715,293 bp with 4,996 predicted protein-coding genes. We found the size of 1RS is larger than 1BS with the active centromere domains shifted to the 1RS side instead of the 1BL side in Aikang58 (AK58). The gene alignment showed excellent synteny with 1BS from wheat and genes from 1RS were expressed well in wheat especially for 1RS where expression was higher than that of 1BS for the grain-20DPA stage associated with greater grain weight and negative flour quality attributes. A formin-like-domain protein FH14 ( TraesAK58CH1B01G010700 ) was important in regulating cell division. Two PPR genes were most likely the genes for the multi fertility restoration locus Rf multi . Our data not only provide the high-resolution structure and gene complement for the 1RS.1BL translocation, but also defined targets for enhancing grain yield, biotic and abiotic stress, and fertility restoration in wheat.

Scope Edible insect proteins are increasingly introduced as an alternative sustainable food source to address the world's need to feed the growing population. Tropomyosin is the main insect allergen; however, additional potential allergens are not well characterized and the impact of extraction procedures on immunological reactivity is unknown. Methods and results Proteins from different commercial food products derived from cricket ( Acheta domesticus ) and black soldier fly (BSF) ( Hermetia illucens ) are extracted using five different extraction buffers. The proteins are analyzed by SDS‐PAGE and immunoblotting using allergen‐specific antibodies and crustacean allergic patient sera. IgE binding bands are analyzed by mass spectrometry as well as the complete allergen profile of all 30 extracts. Urea‐based buffers are most efficient in extracting insect allergens. Shrimp‐specific antibody cross‐reactivity to tropomyosin from cricket and BSF indicates high sequence and structural similarity between shrimp and insects. Additional unique allergens are identified in both species, including hemocyanin, vitellogenin, HSP20, apolipophorin‐III, and chitin‐binding protein. Conclusions Identifying potential allergenic proteins and their isoforms in cricket and BSF requires specific extraction approaches using urea‐based methods. While tropomyosin is the most abundant and immunoreactive allergen, seven unique allergens are identified, highlighting the need for insect species‐specific allergen detection in food products.

Lupins are a promising source of protein that can complement soybean-based proteins in food and animal feed. Narrow-leafed lupin (Lupinus angustifolius) is the predominant lupin species cultivated in Australia and Europe. Consumption of lupin products can lead to toxicity in both humans and animals, primarily due to the presence of naturally occurring alkaloid compounds. The aim of the present research was to examine the alkaloid content of commercial narrow-leafed lupin grown in Australia and compare this to wild accessions. Nineteen accessions of narrow-leafed lupin were grown in a growth chamber with a day/night cycle of 18 h of light and 6 h of darkness. An LC-MS/MS-based method was deployed to detect and quantify the main alkaloids in lupins: angustifoline, 13α-hydroxylupanine, (+) lupanine, sparteine, (-) lupinine, isolupanine, and gramine. The alkaloid content in narrow-leafed lupin exhibited a wide variation among different genotypes. Sweet varieties such as Geebung had remarkably low alkaloid content, below 10 mg/kg. Bitter accessions such as P22660 displayed considerably higher alkaloid levels, as high as 20,000 mg/kg. The level of variation of alkaloids observed within lupin grain from different plant replicates of the same cultivars was significantly greater in sweet phenotypes (SD > 100 %) compared to bitter cultivars (SD < 20 %).

To engineer Mo dependent nitrogenase function in plants expression of proteins NifD and NifK will be an absolute requirement. Although mitochondria have been established as a suitable eukaryotic environment for biosynthesis of oxygen-sensitive enzymes such as NifH, expression of NifD in this organelle has proven difficult due to cryptic NifD degradation. Here we describe a solution to this problem. Using molecular and proteomic methods, we found NifD degradation to be a consequence of mitochondrial endoprotease activity at a specific motif within NifD. Focusing on this functionally sensitive region, we designed NifD variants comprising between one and three amino acid substitutions and distinguished several that were resistant to degradation when expressed in both plant and yeast mitochondria. Nitrogenase activity assays of these resistant variants in E. coli identified a subset that retained function, including a single amino acid (Y100Q) variant. The Y100Q variant also enabled expression of a NifD(Y100Q)-linker-NifK translational polyprotein in plant mitochondria, confirmed by identification of the polyprotein in the soluble fraction of plant extracts. The NifD(Y100Q)-linker-NifK retained function in E. coli based nitrogenase assays, demonstrating this polyprotein permits expression of NifD and NifK in a defined stoichiometry supportive of activity. Our results exemplify how protein design can overcome impediments encountered when expressing synthetic proteins in novel environments. Specifically, these findings outline our progress toward the assembly of the catalytic unit of nitrogenase within mitochondria.

Wheat is the most widely cultivated crop in the world with over 215 million hectares grown annually. However, to meet the demands of a growing global population, breeders face the challenge of increasing wheat production by approximately 60% within the next 40 years. The 10+ Wheat Genomes Project recently sequenced and assembled the genomes of 15 wheat cultivars to develop our understanding of genetic diversity and selection within the pan-genome of wheat. Here, we provide a wheat pan-transcriptome with de novo annotation and differential expression analysis for nine of these wheat cultivars, across multiple different tissues and whole seedlings sampled at dusk/dawn. Analysis of these de novo annotations facilitated the discovery of genes absent from the Chinese Spring reference, identified genes specific to particular cultivars and defined the core and dispensable genomes. Expression analysis across cultivars and tissues revealed conservation in expression between a large core set of homeologous genes, but also widespread changes in subgenome homeolog expression bias between cultivars. Co-expression network analysis revealed the impact of divergence of sub-genome homeolog expression and identified tissue-associated cultivar-specific expression profiles. In summary, this work provides both a valuable resource for the wider wheat community and reveals diversity in gene content and expression patterns between global wheat cultivars.

Industrial nitrogen fertilizer is intrinsic to modern agriculture yet expensive and environmentally harmful. We aim to reconstitute bacterial nitrogenase function within plant mitochondria to reduce nitrogen fertilizer usage. Many nitrogen fixation (Nif) proteins are required for biosynthesis and function of the mature nitrogenase enzyme, and these will need to be correctly processed and soluble within mitochondria as a pre-requisite for function. Here we present our workflow that assessed processing, solubility and relative abundance of 16 Klebsiella oxytoca Nif proteins targeted to the plant mitochondrial matrix using an Arabidopsis mitochondrial targeting peptide (MTP). The functional consequence of the N-terminal modifications required for mitochondrial targeting of Nif proteins was tested using bacterial nitrogenase assays. We found that despite the use of the same constitutive promoter and MTP, MTP::Nif processing and relative abundance in plant leaf varied considerably. Assessment of solubility for all MTP::Nif proteins found NifF, M, N, S, U, W, X, Y and Z were soluble, while NifB, E, H, J, K, Q and V were mostly insoluble. Although most Nif proteins tolerated the N-terminal extension as a consequence of mitochondrial processing, this extension in NifM reduced nitrogenase activity to 10% of controls. Using proteomics, we detected a ~50-fold increase in the abundance of NifM when it contained the N-terminal MTP extension, which may account for this reduction seen in nitrogenase activity. Based on plant mitochondrial processing and solubility, and retention of function in a bacterial assay, our workflow has identified that NifF, N, S, U, W, Y and Z satisfied all these criteria. Future work can now focus on improving these parameters for the remaining Nif components to assemble a complete set of plant-ready Nif proteins for reconstituting nitrogen fixation in plant mitochondria.

In the original publication [...]

Chickpea (Cicer arietinum L.) is the second most widely grown legume crop after soybean. Here, we measured the macronutrients and performed proteome profiling of eight chickpea cultivars using two complementary protein extraction solvents. The total protein, starch, and soluble sugar contents significantly differ between cultivars, and we quantified 2434 and 1809 proteins, respectively, from urea- and water-based extraction solvents using a data-independent acquisition approach. The proteome-level differences can vary from 9–25% for the urea-extracted proteins, and the storage protein abundances significantly differed between the cultivars, where legumin content was detected as the highest, followed by vicilin and albumin. Fifty common allergens were detected from two extraction solvents, primarily overrepresented in chromosomes 3, 4, and 5. Integrated analysis revealed distinct subclusters of proteins and their associated pathways for total protein, lipids, and starch content. Overall, we established chickpea pan-proteome resources and provided insights into the key pathways that define the genotypes.