Drug With a (Re)Purpose Thalidomide, once infamous for its deleterious effects on fetal development, has re-emerged as a drug of great interest because of its beneficial immunomodulatory effects. A derivative drug called lenalidomide significantly extends the survival of patients with multiple myeloma, but the molecular mechanisms underlying its efficacy remain unclear (see the Perspective by Stewart ). Building on a previous observation that thalidomide binds to cereblon, a ubiquitin ligase, Lu et al. (p. 305 , published online 28 November) and Krönke et al. (p. 301 , published online 28 November) show that in the presence of lenalidomide, cereblon selectively targets two B cell transcription factors (Ikaros family members, IKZF1 and IKZF3) for degradation. In myeloma cell lines and patient cells, down-regulation of IKZF1 and IKZF3 was necessary and sufficient for the drug's anticancer activity. Thus, lenalidomide may act, at least in part, by “grepurposing” a ubiquitin ligase.

Mitochondrial Makeup Mapped Because mass spectrometry (MS) cannot be performed on living cells, biologists currently recover spatial information indirectly, by purifying organelles or protein complexes prior to MS analysis. These purifications often yield false positives because of sample contamination and false negatives because of material loss. Rhee et al. (p. 1328 , published online 31 January) present an approach that bridges microscopy and proteomics to produce a spatially and temporally resolved proteomic map of mitochondria from living cells. A nonspecific labeling enzyme (peroxidase) was genetically targeted to the mitochondria within live cells, where it tagged endogenous proteins in a spatially restricted manner within a 1-minute window, for subsequent identification and analysis by MS. This rapid and straightforward technology provides the ability to access otherwise inaccessible cellular regions and requires a very small amount of starting material.

Lenalidomide is a highly effective treatment for myelodysplastic syndrome (MDS) with deletion of chromosome 5q (del(5q)). Here, we demonstrate that lenalidomide induces the ubiquitination of casein kinase 1A1 (CK1α) by the E3 ubiquitin ligase CUL4–RBX1–DDB1–CRBN (known as CRL4CRBN), resulting in CK1α degradation. CK1α is encoded by a gene within the common deleted region for del(5q) MDS and haploinsufficient expression sensitizes cells to lenalidomide therapy, providing a mechanistic basis for the therapeutic window of lenalidomide in del(5q) MDS. We found that mouse cells are resistant to lenalidomide but that changing a single amino acid in mouse Crbn to the corresponding human residue enables lenalidomide-dependent degradation of CK1α. We further demonstrate that minor side chain modifications in thalidomide and a novel analogue, CC-122, can modulate the spectrum of substrates targeted by CRL4CRBN. These findings have implications for the clinical activity of lenalidomide and related compounds, and demonstrate the therapeutic potential of novel modulators of E3 ubiquitin ligases. Lenalidomide, a derivative of thalidomide, is an effective drug for myelodysplastic syndrome; lenalidomide binds the CRL4CRBN E3 ubiquitin ligase and promotes degradation of casein kinase 1a, on which the malignant cells rely for survival. Thalidomide was taken off the market when it was found to cause malformation in children whose mothers had taken it as a treatment for morning sickness in the late 1950s and early 1960s. Later it emerged that thalidomide and derivatives could be successfully used to treat certain haematopoietic disorders, and the thalidomide derivative lenalidomide has proved an effective therapy for myelodysplastic syndrome (MDS). Ben Ebert and colleagues now show why lenalidomide is particularly efficient in so-called del(5q) MDS — a frequent form of MDS carrying deletions in one copy of the chromosome 5q arm. They find that lenalidomide binds the CRL4CRBN E3 ubiquitin ligase and promotes degradation of casein kinase 1α, which the malignant cells rely on for survival. In addition, a new analogue of thalidomide, CC-122, is shown to have greater potency than lenalidomide in inducing degradation of other CRBN substrates that are important in certain B cell malignancies.

The mitochondrial uniporter is a highly selective calcium channel in the organelle's inner membrane. Its molecular components include the EF-hand-containing calcium-binding proteins mitochondrial calcium uptake 1 (MICU1) and MICU2 and the pore-forming subunit mitochondrial calcium uniporter (MCU). We sought to achieve a full molecular characterization of the uniporter holocomplex (uniplex). Quantitative mass spectrometry of affinity-purified uniplex recovered MICU1 and MICU2, MCU and its paralog MCUb, and essential MCU regulator (EMRE), a previously uncharacterized protein. EMRE is a 10-kilodalton, metazoan-specific protein with a single transmembrane domain. In its absence, uniporter channel activity was lost despite intact MCU expression and oligomerization. EMRE was required for the interaction of MCU with MICU1 and MICU2. Hence, EMRE is essential for in vivo uniporter current and additionally bridges the calcium-sensing role of MICU1 and MICU2 with the calcium-conducting role of MCU.

A mass spectrometry–based method using serial enrichments of different post-translational modifications (SEPTM) enables high-coverage proteomic analysis of multiple PTMs from a single biological sample. We report a mass spectrometry–based method for the integrated analysis of protein expression, phosphorylation, ubiquitination and acetylation by serial enrichments of different post-translational modifications (SEPTM) from the same biological sample. This technology enabled quantitative analysis of nearly 8,000 proteins and more than 20,000 phosphorylation, 15,000 ubiquitination and 3,000 acetylation sites per experiment, generating a holistic view of cellular signal transduction pathways as exemplified by analysis of bortezomib-treated human leukemia cells.

In this protocol, Hung et al. describe a method for performing cell compartment–specific proteomics for regions of interest using the engineered ascorbate peroxidase APEX2. This protocol describes a method to obtain spatially resolved proteomic maps of specific compartments within living mammalian cells. An engineered peroxidase, APEX2, is genetically targeted to a cellular region of interest. Upon the addition of hydrogen peroxide for 1 min to cells preloaded with a biotin-phenol substrate, APEX2 generates biotin-phenoxyl radicals that covalently tag proximal endogenous proteins. Cells are then lysed, and biotinylated proteins are enriched with streptavidin beads and identified by mass spectrometry. We describe the generation of an appropriate APEX2 fusion construct, proteomic sample preparation, and mass spectrometric data acquisition and analysis. A two-state stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) protocol is used for proteomic mapping of membrane-enclosed cellular compartments from which APEX2-generated biotin-phenoxyl radicals cannot escape. For mapping of open cellular regions, we instead use a 'ratiometric' three-state SILAC protocol for high spatial specificity. Isotopic labeling of proteins takes 5–7 cell doublings. Generation of the biotinylated proteomic sample takes 1 d, acquiring the mass spectrometric data takes 2–5 d and analysis of the data to obtain the final proteomic list takes 1 week.

Obtaining complete protein inventories for subcellular regions is a challenge that often limits our understanding of cellular function, especially for regions that are impossible to purify and are therefore inaccessible to traditional proteomic analysis. We recently developed a method to map proteomes in living cells with an engineered peroxidase (APEX) that bypasses the need for organellar purification when applied to membrane-bound compartments; however, it was insufficiently specific when applied to unbounded regions that allow APEX-generated radicals to escape. Here, we combine APEX technology with a SILAC-based ratiometric tagging strategy to substantially reduce unwanted background and achieve nanometer spatial resolution. This is applied to map the proteome of the mitochondrial intermembrane space (IMS), which can freely exchange small molecules with the cytosol. Our IMS proteome of 127 proteins has >94% specificity and includes nine newly discovered mitochondrial proteins. This approach will enable scientists to map proteomes of cellular regions that were previously inaccessible.

Here we present an optimized workflow for global proteome and phosphoproteome analysis of tissues or cell lines that uses isobaric tags (TMT (tandem mass tags)-10) for multiplexed analysis and relative quantification, and provides 3× higher throughput than iTRAQ (isobaric tags for absolute and relative quantification)-4-based methods with high intra- and inter-laboratory reproducibility. The workflow was systematically characterized and benchmarked across three independent laboratories using two distinct breast cancer subtypes from patient-derived xenograft models to enable assessment of proteome and phosphoproteome depth and quantitative reproducibility. Each plex consisted of ten samples, each being 300 μg of peptide derived from <50 mg of wet-weight tissue. Of the 10,000 proteins quantified per sample, we could distinguish 7,700 human proteins derived from tumor cells and 3100 mouse proteins derived from the surrounding stroma and blood. The maximum deviation across replicates and laboratories was <7%, and the inter-laboratory correlation for TMT ratio–based comparison of the two breast cancer subtypes was r > 0.88. The maximum deviation for the phosphoproteome coverage was <24% across laboratories, with an average of >37,000 quantified phosphosites per sample and differential quantification correlations of r > 0.72. The full procedure, including sample processing and data generation, can be completed within 10 d for ten tissue samples, and 100 samples can be analyzed in ~4 months using a single LC-MS/MS instrument. The high quality, depth, and reproducibility of the data obtained both within and across laboratories should enable new biological insights to be obtained from mass spectrometry-based proteomics analyses of cells and tissues together with proteogenomic data integration. This protocol describes a workflow for multiplexed deep-scale, quantitative proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissue samples. The procedure includes step-by-step instructions for all stages, from sample preparation to data analysis.

Cellular compartments that cannot be biochemically isolated are challenging to characterize. Here we demonstrate the proteomic characterization of the synaptic clefts that exist at both excitatory and inhibitory synapses. Normal brain function relies on the careful balance of these opposing neural connections, and understanding how this balance is achieved relies on knowledge of their protein compositions. Using a spatially restricted enzymatic tagging strategy, we mapped the proteomes of two of the most common excitatory and inhibitory synaptic clefts in living neurons. These proteomes reveal dozens of synaptic candidates and assign numerous known synaptic proteins to a specific cleft type. The molecular differentiation of each cleft allowed us to identify Mdga2 as a potential specificity factor influencing Neuroligin-2′s recruitment of presynaptic neurotransmitters at inhibitory synapses.

The cytosol-facing membranes of cellular organelles contain proteins that enable signal transduction, regulation of morphology and trafficking, protein import and export, and other specialized processes. Discovery of these proteins by traditional biochemical fractionation can be plagued with contaminants and loss of key components. Using peroxidase-mediated proximity biotinylation, we captured and identified endogenous proteins on the outer mitochondrial membrane (OMM) and endoplasmic reticulum membrane (ERM) of living human fibroblasts. The proteomes of 137 and 634 proteins, respectively, are highly specific and highlight 94 potentially novel mitochondrial or ER proteins. Dataset intersection identified protein candidates potentially localized to mitochondria-ER contact sites. We found that one candidate, the tail-anchored, PDZ-domain-containing OMM protein SYNJ2BP, dramatically increases mitochondrial contacts with rough ER when overexpressed. Immunoprecipitation-mass spectrometry identified ribosome-binding protein 1 (RRBP1) as SYNJ2BP's ERM binding partner. Our results highlight the power of proximity biotinylation to yield insights into the molecular composition and function of intracellular membranes.