Nuclear pore complexes play central roles as gatekeepers of RNA and protein transport between the cytoplasm and nucleoplasm. However, their large size and dynamic nature have impeded a full structural and functional elucidation. Here we determined the structure of the entire 552-protein nuclear pore complex of the yeast Saccharomyces cerevisiae at sub-nanometre precision by satisfying a wide range of data relating to the molecular arrangement of its constituents. The nuclear pore complex incorporates sturdy diagonal columns and connector cables attached to these columns, imbuing the structure with strength and flexibility. These cables also tie together all other elements of the nuclear pore complex, including membrane-interacting regions, outer rings and RNA-processing platforms. Inwardly directed anchors create a high density of transport factor-docking Phe-Gly repeats in the central channel, organized into distinct functional units. This integrative structure enables us to rationalize the architecture, transport mechanism and evolutionary origins of the nuclear pore complex.

Elucidation of endogenous cellular protein-protein interactions and their networks is most desirable for biological studies. Here we report our study of endogenous human coregulator protein complex networks obtained from integrative mass spectrometry-based analysis of 3290 affinity purifications. By preserving weak protein interactions during complex isolation and utilizing high levels of reciprocity in the large dataset, we identified many unreported protein associations, such as a transcriptional network formed by ZMYND8, ZNF687, and ZNF592. Furthermore, our work revealed a tiered interplay within networks that share common proteins, providing a conceptual organization of a cellular proteome composed of minimal endogenous modules (MEMOs), complex isoforms (uniCOREs), and regulatory complex-complex interaction networks (CCIs). This resource will effectively fill a void in linking correlative genomic studies with an understanding of transcriptional regulatory protein functions within the proteome for formulation and testing of future hypotheses.

Nanobodies that neutralize Monoclonal antibodies that bind to the spike protein of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) show therapeutic promise but must be produced in mammalian cells and need to be delivered intravenously. By contrast, single-domain antibodies called nanobodies can be produced in bacteria or yeast, and their stability may enable aerosol delivery. Two papers now report nanobodies that bind tightly to spike and efficiently neutralize SARS-CoV-2 in cells. Schoof et al. screened a yeast surface display of synthetic nanobodies and Xiang et al. screened anti-spike nanobodies produced by a llama. Both groups identified highly potent nanobodies that lock the spike protein in an inactive conformation. Multivalent constructs of selected nanobodies achieved even more potent neutralization. Science , this issue p. 1473 , p. 1479

Abstract The outbreak of COVID-19 has severely impacted global health and the economy. Cost-effective, highly efficacious therapeutics are urgently needed. Here, we used camelid immunization and proteomics to identify a large repertoire of highly potent neutralizing nanobodies (Nbs) to the SARS-CoV-2 spike (S) protein receptor-binding domain (RBD). We discovered multiple elite Nbs with picomolar to femtomolar affinities that inhibit viral infection at sub-ng/ml concentration, more potent than some of the best human neutralizing antibodies. We determined a crystal structure of such an elite neutralizing Nb in complex with RBD. Structural proteomics and integrative modeling revealed multiple distinct and non-overlapping epitopes and indicated an array of potential neutralization mechanisms. Structural characterization facilitated the bioengineering of novel multivalent Nb constructs into multi-epitope cocktails that achieved ultrahigh neutralization potency (IC50s as low as 0.058 ng/ml) and may prevent mutational escape. These thermostable Nbs can be rapidly produced in bulk from microbes and resist lyophilization, and aerosolization. These promising agents are readily translated into efficient, cost-effective, and convenient therapeutics to help end this once-in-a-century health crisis.

There is an urgent need to develop effective interventions resistant to the evolving variants of SARS-CoV-2. Nanobodies (Nbs) are stable and cost-effective agents that can be delivered by novel aerosolization route to treat SARS-CoV-2 infections efficiently. However, it remains unknown if they possess broadly neutralizing activities against the prevalent circulating strains. We found that potent neutralizing Nbs are highly resistant to the convergent variants of concern that evade a large panel of neutralizing antibodies (Abs) and significantly reduce the activities of convalescent or vaccine-elicited sera. Subsequent determination of 9 high-resolution structures involving 6 potent neutralizing Nbs by cryoelectron microscopy reveals conserved and novel epitopes on virus spike inaccessible to Abs. Systematic structural comparison of neutralizing Abs and Nbs provides critical insights into how Nbs uniquely target the spike to achieve high-affinity and broadly neutralizing activity against the evolving virus. Our study will inform the rational design of novel pan-coronavirus vaccines and therapeutics.

Abstract Globally there is an urgency to develop effective, low-cost therapeutic interventions for coronavirus disease 2019 (COVID-19). We previously generated the stable and ultrapotent homotrimeric Pittsburgh inhalable Nanobody 21 (PiN-21). Using Syrian hamsters that model moderate to severe COVID-19 disease, we demonstrate the high efficacy of PiN-21 to prevent and treat SARS-CoV-2 infection. Intranasal delivery of PiN-21 at 0.6 mg/kg protects infected animals from weight loss and substantially reduces viral burdens in both lower and upper airways compared to control. Aerosol delivery of PiN-21 facilitates deposition throughout the respiratory tract and dose minimization to 0.2 mg/kg. Inhalation treatment quickly reverses animals’ weight loss post-infection and decreases lung viral titers by 6 logs leading to drastically mitigated lung pathology and prevents viral pneumonia. Combined with the marked stability and low production cost, this novel therapy may provide a convenient and cost-effective option to mitigate the ongoing pandemic.

SARS-CoV-2 Omicron variant of concern (VOC) contains fifteen mutations on the receptor binding domain (RBD), evading most neutralizing antibodies from vaccinated sera. Emerging evidence suggests that Omicron breakthrough cases are associated with substantially lower antibody titers than other VOC cases. However, the mechanism remains unclear. Here, using a novel geometric deep-learning model, we discovered that the antigenic profile of Omicron RBD is distinct from the prior VOCs, featuring reduced antigenicity in its remodeled receptor binding sites (RBS). To substantiate our deep-learning prediction, we immunized mice with different recombinant RBD variants and found that the Omicron's extensive mutations can lead to a drastically attenuated serologic response with limited neutralizing activity in vivo , while the T cell response remains potent. Analyses of serum cross-reactivity and competitive ELISA with epitope-specific nanobodies revealed that the antibody response to Omicron was reduced across RBD epitopes, including both the variable RBS and epitopes without any known VOC mutations. Moreover, computational modeling confirmed that the RBS is highly versatile with a capacity to further decrease antigenicity while retaining efficient receptor binding. Longitudinal analysis showed that this evolutionary trend of decrease in antigenicity was also found in hCoV229E, a common cold coronavirus that has been circulating in humans for decades. Thus, our study provided unprecedented insights into the reduced antibody titers associated with Omicron infection, revealed a possible trajectory of future viral evolution and may inform the vaccine development against future outbreaks.

Abstract Therapeutic and diagnostic efficacies of numerous small biomolecules and chemical compounds are hampered by the short half-lives. Here we report the development of a repertoire of diverse, high-affinity albumin-nanobodies (Nb HSA ) to facilitate drug delivery. By integrating biophysics, and hybrid structural biology, we have systematically characterized the Nb HSA for albumin binding, mapped the epitopes, and resolved the architecture of a tetrameric Nb-albumin complex. We employed quantitative proteomics for accurate, multiplex Nb pharmacokinetic analysis. Using a humanized albumin mouse model, we found that the Nb HSA has outstanding pharmacokinetics; the most stable Nb HSA has a 771-fold T 1/2 improvement compared with a control Nb. Interestingly, the pharmacokinetics of Nb HSA is related to their biophysical and structural properties. To demonstrate the utility of Nb HSA , we developed a highly stable Nb HSA -hIL-2 cytokine conjugate “Duraleukin” and confirmed its improved anticancer properties than hIL-2 alone. We envision that this high-quality Nb resource will advance research into novel biotherapeutics.

Summary The humoral immune response is essential for the survival of mammals. However, we still lack a systematic understanding of the specific serologic antibody repertoire in response to an antigen. We developed a proteomic strategy to survey, at an unprecedented scale, the landscapes of antigen-engaged, serum-circulating repertoires of camelid heavy-chain antibodies (hcAbs). The sensitivity and robustness of this technology were validated using three antigens spanning orders of magnitude in immune response; thousands of divergent, high-affinity hcAb families were confidently identified and quantified. Using high-throughput structural modeling, cross-linking mass spectrometry, mutagenesis, and deep learning, we mapped and analyzed the epitopes of > 100,000 antigen-antibody complexes. Our results revealed a surprising diversity of high-affinity hcAbs for specific antigen binding on a variety of dominant epitopes. hcAbs perfect both shape and charge complementarity to target challenging antigens specifically; they can rapidly evolve to recognize a conserved, promiscuous cellular protein interaction interface, unraveling the convergent force that drives protein-protein interactions.

Abstract Vaccine boosters and infection can facilitate the development of SARS-CoV-2 antibodies with improved potency and breadth. Here, we observed super-immunity in a camelid extensively immunized with the SARS-CoV-2 receptor-binding domain (RBD). We rapidly isolated a large repertoire of specific ultrahigh-affinity nanobodies that bind strongly to all known sarbecovirus clades using integrative proteomics. These pan-sarbecovirus nanobodies (psNbs) are highly effective against SARS-CoV and SARS-CoV-2 variants including the Omicron, with the best median neutralization potency at single-digit ng/ml. Structural determinations of 13 psNbs with the SARS-CoV-2 spike or RBD revealed five epitope classes, providing insights into the mechanisms and evolution of their broad activities. The highly evolved psNbs target small, flat, and flexible epitopes that contain over 75% of conserved RBD surface residues. Their potencies are strongly and negatively correlated with the distance of the epitopes to the receptor binding sites. A highly potent, inhalable and bispecific psNb (PiN-31) was developed. Our findings inform on the development of broadly protective vaccines and therapeutics. One sentence summary Successive immunization of SARS-CoV-2 RBD in a camelid enhanced the development of super-immunity and isolation and systematic characterization of a large repertoire of ultrahigh-affinity pan-sarbecovirus single-chain V H H antibodies to understand the evolution of this potent and broad immune response.