Tissue culture of immortal cell strains from diseased patients is an invaluable resource for medical research but is largely limited to tumor cell lines or transformed derivatives of native tissues. Here we describe the generation of induced pluripotent stem (iPS) cells from patients with a variety of genetic diseases with either Mendelian or complex inheritance; these diseases include adenosine deaminase deficiency-related severe combined immunodeficiency (ADA-SCID), Shwachman-Bodian-Diamond syndrome (SBDS), Gaucher disease (GD) type III, Duchenne (DMD) and Becker muscular dystrophy (BMD), Parkinson disease (PD), Huntington disease (HD), juvenile-onset, type 1 diabetes mellitus (JDM), Down syndrome (DS)/trisomy 21, and the carrier state of Lesch-Nyhan syndrome. Such disease-specific stem cells offer an unprecedented opportunity to recapitulate both normal and pathologic human tissue formation in vitro, thereby enabling disease investigation and drug development.

Ectopic expression of the four transcription factors Oct4, Sox2, c-Myc, and Klf4 is sufficient to confer a pluripotent state upon the fibroblast genome, generating induced pluripotent stem (iPS) cells. It remains unknown if nuclear reprogramming induced by these four factors globally resets epigenetic differences between differentiated and pluripotent cells. Here, using novel selection approaches, we have generated iPS cells from fibroblasts to characterize their epigenetic state. Female iPS cells showed reactivation of a somatically silenced X chromosome and underwent random X inactivation upon differentiation. Genome-wide analysis of two key histone modifications indicated that iPS cells are highly similar to ES cells. Consistent with these observations, iPS cells gave rise to viable high-degree chimeras with contribution to the germline. These data show that transcription factor-induced reprogramming leads to the global reversion of the somatic epigenome into an ES-like state. Our results provide a paradigm for studying the epigenetic modifications that accompany nuclear reprogramming and suggest that abnormal epigenetic reprogramming does not pose a problem for the potential therapeutic applications of iPS cells.

Pluripotent stem cells have been generated from mouse and human somatic cells by viral expression of the transcription factors Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc. A major limitation of this technology is the use of potentially harmful genome-integrating viruses. We generated mouse induced pluripotent stem (iPS) cells from fibroblasts and liver cells by using nonintegrating adenoviruses transiently expressing Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc. These adenoviral iPS (adeno-iPS) cells show DNA demethylation characteristic of reprogrammed cells, express endogenous pluripotency genes, form teratomas, and contribute to multiple tissues, including the germ line, in chimeric mice. Our results provide strong evidence that insertional mutagenesis is not required for in vitro reprogramming. Adenoviral reprogramming may provide an improved method for generating and studying patient-specific stem cells and for comparing embryonic stem cells and iPS cells.

Polo et al. show that early-passage induced pluripotent stem cells retain an epigenetic memory of their cell type of origin. These epigenetic differences affect the cells’ differentiation potential and might be exploited to generate particular cell types of interest. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been derived from various somatic cell populations through ectopic expression of defined factors. It remains unclear whether iPSCs generated from different cell types are molecularly and functionally similar. Here we show that iPSCs obtained from mouse fibroblasts, hematopoietic and myogenic cells exhibit distinct transcriptional and epigenetic patterns. Moreover, we demonstrate that cellular origin influences the in vitro differentiation potentials of iPSCs into embryoid bodies and different hematopoietic cell types. Notably, continuous passaging of iPSCs largely attenuates these differences. Our results suggest that early-passage iPSCs retain a transient epigenetic memory of their somatic cells of origin, which manifests as differential gene expression and altered differentiation capacity. These observations may influence ongoing attempts to use iPSCs for disease modeling and could also be exploited in potential therapeutic applications to enhance differentiation into desired cell lineages.

The POU-domain transcription factor Oct-4 is normally expressed in pluripotent cells of the mammalian embryo. In addition, germ-cell tumors and a few somatic tumors show detectable expression of Oct-4. While Oct-4's role during preimplantation development is to maintain embryonic cells in a pluripotent state, little is known about its potential oncogenic properties. Here we investigate the effect of ectopic Oct-4 expression on somatic tissues of adult mice using a doxycycline-dependent expression system. Activation of Oct-4 results in dysplastic growths in epithelial tissues that are dependent on continuous Oct-4 expression. Dysplastic lesions show an expansion of progenitor cells and increased beta-catenin transcriptional activity. In the intestine, Oct-4 expression causes dysplasia by inhibiting cellular differentiation in a manner similar to that in embryonic cells. These data show that certain adult progenitors remain competent to interpret key embryonic signals and support the notion that progenitor cells are a driving force in tumorigenesis.

Pluripotency can be induced in somatic cells by overexpression of a set of transcription factors. The process has extremely low efficiency and slow kinetics. Here Utikal et al. show that cells with low endogenous p19Arf levels and immortal fibroblasts deficient for components of the Ink4a/Arf/p53 pathway yield iPS colonies with a threefold faster kinetics and at a significantly higher efficiency compared with wild-type cells, reaching frequencies of up to 100%. Genetic deletion of p53 in cellular subpopulations that normally fail to reprogram rescues their ability to produce iPS cells. Pluripotency can be induced in somatic cells by overexpression of a set of transcription factors, but the process has extremely low efficiency and slow kinetics. Here, cells with low endogenous p19Arf levels and immortal fibroblasts deficient for components of the Arf–Trp53 pathway yield induced pluripotent stem cell colonies with up to threefold faster kinetics and at a significantly higher efficiency than wild-type cells, reaching frequencies of up to 100%. The overexpression of defined transcription factors in somatic cells results in their reprogramming into induced pluripotent stem (iPS) cells1,2,3. The extremely low efficiency and slow kinetics of in vitro reprogramming suggest that further rare events are required to generate iPS cells. The nature and identity of these events, however, remain elusive. We noticed that the reprogramming potential of primary murine fibroblasts into iPS cells decreases after serial passaging and the concomitant onset of senescence. Consistent with the notion that loss of replicative potential provides a barrier for reprogramming, here we show that cells with low endogenous p19Arf (encoded by the Ink4a/Arf locus, also known as Cdkn2a locus) protein levels and immortal fibroblasts deficient in components of the Arf–Trp53 pathway yield iPS cell colonies with up to threefold faster kinetics and at a significantly higher efficiency than wild-type cells, endowing almost every somatic cell with the potential to form iPS cells. Notably, the acute genetic ablation of Trp53 (also known as p53) in cellular subpopulations that normally fail to reprogram rescues their ability to produce iPS cells. Our results show that the acquisition of immortality is a crucial and rate-limiting step towards the establishment of a pluripotent state in somatic cells and underscore the similarities between induced pluripotency and tumorigenesis.

Factor-induced reprogramming of somatic cells into induced pluripotent stem cells (iPSCs) is inefficient, complicating mechanistic studies. Here, we examined defined intermediate cell populations poised to becoming iPSCs by genome-wide analyses. We show that induced pluripotency elicits two transcriptional waves, which are driven by c-Myc/Klf4 (first wave) and Oct4/Sox2/Klf4 (second wave). Cells that become refractory to reprogramming activate the first but fail to initiate the second transcriptional wave and can be rescued by elevated expression of all four factors. The establishment of bivalent domains occurs gradually after the first wave, whereas changes in DNA methylation take place after the second wave when cells acquire stable pluripotency. This integrative analysis allowed us to identify genes that act as roadblocks during reprogramming and surface markers that further enrich for cells prone to forming iPSCs. Collectively, our data offer new mechanistic insights into the nature and sequence of molecular events inherent to cellular reprogramming.

Ectopic expression of the transcription factors Oct4, Sox2, c-Myc, and Klf4 in fibroblasts generates induced pluripotent stem (iPS) cells. Little is known about the nature and sequence of molecular events accompanying nuclear reprogramming. Using doxycycline-inducible vectors, we have shown that exogenous factors are required for about 10 days, after which cells enter a self-sustaining pluripotent state. We have identified markers that define cell populations prior to and during this transition period. While downregulation of Thy1 and subsequent upregulation of SSEA-1 occur at early time points, reactivation of endogenous Oct4, Sox2, telomerase, and the silent X chromosome mark late events in the reprogramming process. Cell sorting with these markers allows for a significant enrichment of cells with the potential to become iPS cells. Our results suggest that factor-induced reprogramming is a gradual process with defined intermediate cell populations that contain the majority of cells poised to become iPS cells.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been generated by enforced expression of defined sets of transcription factors in somatic cells. It remains controversial whether iPSCs are molecularly and functionally equivalent to blastocyst-derived embryonic stem (ES) cells. By comparing genetically identical mouse ES cells and iPSCs, we show here that their overall messenger RNA and microRNA expression patterns are indistinguishable with the exception of a few transcripts encoded within the imprinted Dlk1–Dio3 gene cluster on chromosome 12qF1, which were aberrantly silenced in most of the iPSC clones. Consistent with a developmental role of the Dlk1–Dio3 gene cluster, these iPSC clones contributed poorly to chimaeras and failed to support the development of entirely iPSC-derived animals (‘all-iPSC mice’). In contrast, iPSC clones with normal expression of the Dlk1–Dio3 cluster contributed to high-grade chimaeras and generated viable all-iPSC mice. Notably, treatment of an iPSC clone that had silenced Dlk1–Dio3 with a histone deacetylase inhibitor reactivated the locus and rescued its ability to support full-term development of all-iPSC mice. Thus, the expression state of a single imprinted gene cluster seems to distinguish most murine iPSCs from ES cells and allows for the prospective identification of iPSC clones that have the full development potential of ES cells. The extent to which iPS (induced pluripotent stem) cells are equivalent to embryonic stem (ES) cells is an open question. Some reports claim that hundreds of genes are aberrantly expressed in iPS compared with ES cells, yet iPS cells can satisfy one of the most stringent tests for developmental potential by producing all-iPS cell mice via tetraploid embryo complementation. To address this question with a minimum of complicating factors, Stadtfeld et al. compared gene expression in genetically identical mouse ES and iPS cells. They find overall mRNA and microRNA expression patterns that are indistinguishable, apart from a few transcripts and fewer than 20 microRNAs encoded by an imprinted gene cluster on chromosome 12qF1. The developmental potential of iPS cells depends on whether genes are silenced or active on this site. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are generated by the enforced expression of particular transcription factors in somatic cells. The extent to which such cells are equivalent to embryonic stem (ES) cells is an open question. Here, genetically identical mouse ES cells and iPSCs have been compared; the overall expression patterns of messenger RNAs and microRNAs are the same, with the exception of a few transcripts encoded within an imprinted gene cluster on chromosome 12qF1.