Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) technologies are poised to reshape the current cell-type classification system. However, a transcriptome-based single-cell atlas has not been achieved for complex mammalian systems. Here, we developed Microwell-seq, a high-throughput and low-cost scRNA-seq platform using simple, inexpensive devices. Using Microwell-seq, we analyzed more than 400,000 single cells covering all of the major mouse organs and constructed a basic scheme for a mouse cell atlas (MCA). We reveal a single-cell hierarchy for many tissues that have not been well characterized previously. We built a web-based "single-cell MCA analysis" pipeline that accurately defines cell types based on single-cell digital expression. Our study demonstrates the wide applicability of the Microwell-seq technology and MCA resource.

Imaging the transcriptome in situ with high accuracy has been a major challenge in single-cell biology, which is particularly hindered by the limits of optical resolution and the density of transcripts in single cells1–5. Here we demonstrate an evolution of sequential fluorescence in situ hybridization (seqFISH+). We show that seqFISH+ can image mRNAs for 10,000 genes in single cells—with high accuracy and sub-diffraction-limit resolution—in the cortex, subventricular zone and olfactory bulb of mouse brain, using a standard confocal microscope. The transcriptome-level profiling of seqFISH+ allows unbiased identification of cell classes and their spatial organization in tissues. In addition, seqFISH+ reveals subcellular mRNA localization patterns in cells and ligand–receptor pairs across neighbouring cells. This technology demonstrates the ability to generate spatial cell atlases and to perform discovery-driven studies of biological processes in situ. seqFISH+, an evolution of sequential fluorescence in situ hybridization with super-resolution imaging capabilities, is used to image mRNAs of 10,000 genes in cultured cells and mouse brain slices, demonstrating the ability to generate spatial atlases and to perform discovery-driven studies in situ.

The positioning of nucleosomes along chromatin has been implicated in the regulation of gene expression in eukaryotic cells, because packaging DNA into nucleosomes affects sequence accessibility. We developed a tiled microarray approach to identify at high resolution the translational positions of 2278 nucleosomes over 482 kilobases of Saccharomyces cerevisiae DNA, including almost all of chromosome III and 223 additional regulatory regions. The majority of the nucleosomes identified were well-positioned. We found a stereotyped chromatin organization at Pol II promoters consisting of a nucleosome-free region ∼200 base pairs upstream of the start codon flanked on both sides by positioned nucleosomes. The nucleosome-free sequences were evolutionarily conserved and were enriched in poly-deoxyadenosine or poly-deoxythymidine sequences. Most occupied transcription factor binding motifs were devoid of nucleosomes, strongly suggesting that nucleosome positioning is a global determinant of transcription factor access.

Trimethylation on H3K27 (H3K27me3) mediated by Polycomb repressive complex 2 (PRC2) has been linked to embryonic stem cell (ESC) identity and pluripotency. EZH2, the catalytic subunit of PRC2, has been reported as the sole histone methyltransferase that methylates H3K27 and mediates transcriptional silencing. Analysis of Ezh2−/− ESCs suggests existence of an additional enzyme(s) catalyzing H3K27 methylation. We have identified EZH1, a homolog of EZH2 that is physically present in a noncanonical PRC2 complex, as an H3K27 methyltransferase in vivo and in vitro. EZH1 colocalizes with the H3K27me3 mark on chromatin and preferentially preserves this mark on development-related genes in Ezh2−/− ESCs. Depletion of Ezh1 in cells lacking Ezh2 abolishes residual methylation on H3K27 and derepresses H3K27me3 target genes, demonstrating a role of EZH1 in safeguarding ESC identity. Ezh1 partially complements Ezh2 in executing pluripotency during ESC differentiation, suggesting that cell-fate transitions require epigenetic specificity.

Enhancers, critical determinants of cellular identity, are commonly recognized by correlative chromatin marks and gain-of-function potential, although only loss-of-function studies can demonstrate their requirement in the native genomic context. Previously, we identified an erythroid enhancer of human BCL11A, subject to common genetic variation associated with the fetal haemoglobin level, the mouse orthologue of which is necessary for erythroid BCL11A expression. Here we develop pooled clustered regularly interspaced palindromic repeat (CRISPR)-Cas9 guide RNA libraries to perform in situ saturating mutagenesis of the human and mouse enhancers. This approach reveals critical minimal features and discrete vulnerabilities of these enhancers. Despite conserved function of the composite enhancers, their architecture diverges. The crucial human sequences appear to be primate-specific. Through editing of primary human progenitors and mouse transgenesis, we validate the BCL11A erythroid enhancer as a target for fetal haemoglobin reinduction. The detailed enhancer map will inform therapeutic genome editing, and the screening approach described here is generally applicable to functional interrogation of non-coding genomic elements. A CRISPR-Cas9 approach is used to perform saturating mutagenesis of the human and mouse BCL11A enhancers, producing a map that reveals critical regions and specific vulnerabilities; BCL11A enhancer disruption is validated by CRISPR-Cas9 as a therapeutic strategy for inducing fetal haemoglobin by applying it in both mice and primary human erythroblast cells. BCL11A is a transcriptional repressor that inhibits expression of fetal globin genes in adults, and is a potential therapeutic target for the treatment of β-globinopathies such as β-thalassemia and sickle cell disease. The enhancer of BCL11A is subject to common genetic variation associated with fetal hemoglobin level. Here, Daniel Bauer and colleagues use a CRISPR–Cas9 approach to perform saturation mutagenesis of the human and mouse BCL11A enhancers, producing a map that reveals critical regions and specific vulnerabilities. They validate BCL11A enhancer disruption by CRISPR–Cas9 as a therapeutic strategy for inducing fetal haemoglobin by applying it in both mice and primary human erythroblast cells.

SNF'ing out antitumor immunity Immune checkpoint inhibitors induce durable tumor regressions in some, but not all, cancer patients. Understanding the mechanisms that determine tumor sensitivity to these drugs could potentially expand the number of patients who benefit (see the Perspective by Ghorani and Quezada). Pan et al. discovered that tumor cells in which a specific SWI/SNF chromatin remodeling complex had been experimentally inactivated were more sensitive to T cell–mediated killing. The cells were more responsive to interferon-γ, leading to increased secretion of cytokines that promote antitumor immunity. Miao et al. examined the genomic features of tumors from patients with metastatic renal cell carcinoma who had been treated with immune checkpoint inhibitors. Tumors harboring inactivating mutations in PBRM1 , which encodes a subunit of the same SWI/SNF complex, were more likely to respond to the drugs. Science , this issue p. 770 , p. 801 ; see also p. 745

BCL11A Variants Recent chromatin mapping data have suggested that trait-associated variants often mark regulatory DNA. However, there has been little rigorous experimental investigation of regulatory variation. Bauer et al. (p. 253 ; see the Perspective by Hardison and Blobel ) performed an in-depth study of the BCL11A fetal hemoglobin-associated locus. The trait-associated variants revealed a chromatin signature that enhanced erythroid development. The enhancer was required for erythroid expression of BCL11A and thus for globin gene expression.

The MYC oncoproteins are thought to stimulate tumor cell growth and proliferation through amplification of gene transcription, a mechanism that has thwarted most efforts to inhibit MYC function as potential cancer therapy. Using a covalent inhibitor of cyclin-dependent kinase 7 (CDK7) to disrupt the transcription of amplified MYCN in neuroblastoma cells, we demonstrate downregulation of the oncoprotein with consequent massive suppression of MYCN-driven global transcriptional amplification. This response translated to significant tumor regression in a mouse model of high-risk neuroblastoma, without the introduction of systemic toxicity. The striking treatment selectivity of MYCN-overexpressing cells correlated with preferential downregulation of super-enhancer-associated genes, including MYCN and other known oncogenic drivers in neuroblastoma. These results indicate that CDK7 inhibition, by selectively targeting the mechanisms that promote global transcriptional amplification in tumor cells, may be useful therapy for cancers that are driven by MYC family oncoproteins.

Spatial transcriptomic and proteomic technologies have provided new opportunities to investigate cells in their native microenvironment. Here we present Giotto, a comprehensive and open-source toolbox for spatial data analysis and visualization. The analysis module provides end-to-end analysis by implementing a wide range of algorithms for characterizing tissue composition, spatial expression patterns, and cellular interactions. Furthermore, single-cell RNAseq data can be integrated for spatial cell-type enrichment analysis. The visualization module allows users to interactively visualize analysis outputs and imaging features. To demonstrate its general applicability, we apply Giotto to a wide range of datasets encompassing diverse technologies and platforms.

Long noncoding RNAs (lncRNAs) have recently been implicated in many biological processes and diseases. Atherosclerosis is a major risk factor for cardiovascular disease. However, the functional role of lncRNAs in atherosclerosis is largely unknown.We identified lincRNA-p21 as a key regulator of cell proliferation and apoptosis during atherosclerosis. The expression of lincRNA-p21 was dramatically downregulated in atherosclerotic plaques of ApoE(-/-) mice, an animal model for atherosclerosis. Through loss- and gain-of-function approaches, we showed that lincRNA-p21 represses cell proliferation and induces apoptosis in vascular smooth muscle cells and mouse mononuclear macrophage cells in vitro. Moreover, we found that inhibition of lincRNA-p21 results in neointimal hyperplasia in vivo in a carotid artery injury model. Genome-wide analysis revealed that lincRNA-p21 inhibition dysregulated many p53 targets. Furthermore, lincRNA-p21, a transcriptional target of p53, feeds back to enhance p53 transcriptional activity, at least in part, via binding to mouse double minute 2 (MDM2), an E3 ubiquitin-protein ligase. The association of lincRNA-p21 and MDM2 releases MDM2 repression of p53, enabling p53 to interact with p300 and to bind to the promoters/enhancers of its target genes. Finally, we show that lincRNA-p21 expression is decreased in patients with coronary artery disease.Our studies identify lincRNA-p21 as a novel regulator of cell proliferation and apoptosis and suggest that this lncRNA could serve as a therapeutic target to treat atherosclerosis and related cardiovascular disorders.