Drug discovery campaigns against Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) are beginning to target the viral RNA genome 1, 2 . The frameshift stimulation element (FSE) of the SARS-CoV-2 genome is required for balanced expression of essential viral proteins and is highly conserved, making it a potential candidate for antiviral targeting by small molecules and oligonucleotides 3-6 . To aid global efforts focusing on SARS-CoV-2 frameshifting, we report exploratory results from frameshifting and cellular replication experiments with locked nucleic acid (LNA) antisense oligonucleotides (ASOs), which support the FSE as a therapeutic target but highlight difficulties in achieving strong inactivation. To understand current limitations, we applied cryogenic electron microscopy (cryo-EM) and the Ribosolve 7 pipeline to determine a three-dimensional structure of the SARS-CoV-2 FSE, validated through an RNA nanostructure tagging method. This is the smallest macromolecule (88 nt; 28 kDa) resolved by single-particle cryo-EM at subnanometer resolution to date. The tertiary structure model, defined to an estimated accuracy of 5.9 Å, presents a topologically complex fold in which the 5' end threads through a ring formed inside a three-stem pseudoknot. Our results suggest an updated model for SARS-CoV-2 frameshifting as well as binding sites that may be targeted by next generation ASOs and small molecules.

Abstract Breakthroughs in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) technology have made near-atomic resolution structure determination possible. Here, we report a ∼1.35-Å structure of apoferritin reconstructed from images recorded on a Gatan K3 or a Thermo Fisher Falcon 4 detector in a commonly available 300-kV Titan Krios microscope (G3i) equipped with or without a Gatan post-column energy filter. Our results demonstrate that the atomic-resolution structure determination can be achieved by single-particle cryo-EM with a fraction of a day of automated data collection. These structures resolve unambiguously each heavy atom (C, N, O, and S) in the amino acid side chains with an indication of hydrogen atoms’ presence and position, as well as the unambiguous existence of multiple rotameric configurations for some residues. We also develop a statistical and chemical based protocol to assess the positions of the water molecules directly from the cryo-EM map. In addition, we have introduced a B’ factor equivalent to the conventional B factor traditionally used by crystallography to annotate the atomic resolution model for determined structures. Our findings will be of immense interest among protein and medicinal scientists engaging in both basic and translational research.

SUMMARY The ATP-dependent ring-shaped chaperonin TRiC/CCT is essential for cellular proteostasis. To uncover why some eukaryotic proteins can only fold with TRiC assistance, we reconstituted the folding of β-tubulin using human Prefoldin and TRiC. We find unstructured β-tubulin is delivered by Prefoldin to the open TRiC chamber followed by ATP-dependent chamber closure. CryoEM resolves four near-atomic resolution structures containing progressively folded β-tubulin intermediates within the closed TRiC chamber, culminating in native tubulin. This substrate folding pathway appears closely guided by site-specific interactions with conserved regions in the TRiC chamber. Initial electrostatic interactions between the TRiC interior wall and both the folded tubulin N-domain and its C-terminal E-hook tail establish the native substrate topology, thus enabling C-domain folding. Disordered CCT C-termini within the chamber promote subsequent folding of tubulin Core and Middle domains and GTP-binding. Thus, TRiC’s chamber provides chemical and topological directives that shape the folding landscape of its obligate substrates.

Abstract All positive-strand (+) RNA viruses assemble membrane-associated replication complexes (RCs) for viral RNA synthesis in virus-infected cells. However, how these multi-component RCs assemble and function in synthesizing, processing, and transporting viral RNAs to the cytosol remains poorly defined. Here, we determined both the structure of the core RNA replicase of chikungunya virus (family Togaviridae ) at a near-atomic level and the native RC architecture in its cellular context at the subnanometer resolution, using in vitro reconstitution and in situ electron cryotomography, respectively. Within the core RNA replicase (nsP1+2+4), the viral RNA-dependent RNA polymerase nsP4, in complex with nsP2 helicase-protease, was found to co-fold with the membrane-anchored nsP1 RNA-capping dodecameric ring and is located asymmetrically within nsP1 central pore. This complex forms the minimal core RNA replicase, while the addition of a large cytoplasmic ring next to the C-terminus of nsP1 forms the holo-RNA-RC as observed at the neck of spherules formed in virus-infected cells. These results represent a major conceptual advance in elucidating the molecular mechanisms of RNA virus replication and the principles underlying the molecular architecture of RCs, likely to be shared with many pathogenic (+) RNA viruses. At last, our study will direct the needed development of antiviral therapies targeting RCs of pathogenic viruses. Summary CryoEM structure of the chikungunya virus replication complex reveals a multicomponent RNA synthesis nanomachine embedded in the plasma membrane of the host cell.

Abstract This paper describes outcomes of the 2019 Cryo-EM Map-based Model Metrics Challenge sponsored by EMDataResource ( www.emdataresource.org ). The goals of this challenge were (1) to assess the quality of models that can be produced using current modeling software, (2) to check the reproducibility of modeling results from different software developers and users, and (3) compare the performance of current metrics used for evaluation of models. The focus was on near-atomic resolution maps with an innovative twist: three of four target maps formed a resolution series (1.8 to 3.1 Å) from the same specimen and imaging experiment. Tools developed in previous challenges were expanded for managing, visualizing and analyzing the 63 submitted coordinate models, and several novel metrics were introduced. The results permit specific recommendations to be made about validating near-atomic cryo-EM structures both in the context of individual laboratory experiments and holdings of structure data archives such as the Protein Data Bank. Our findings demonstrate the relatively high accuracy and reproducibility of cryo-EM models derived from these benchmark maps by 13 participating teams, representing both widely used and novel modeling approaches. We also evaluate the pros and cons of the commonly used metrics to assess model quality and recommend the adoption of multiple scoring parameters to provide full and objective annotation and assessment of the model, reflective of the observed density in the cryo-EM map.

ABSTRACT Much remains to be explored regarding the diversity of uncultured, host-associated microbes. Here, we report the discovery of unusual rectangular bacterial structures (RBSs) in the mouths of bottlenose dolphins. DNA staining revealed multiple paired bands within RBSs that suggested cells dividing along the longitudinal axis. Cryogenic transmission electron microscopy and tomography revealed parallel membrane-bound segments, suspected to be cells, encapsulated by an S-layer-like periodic surface covering. RBSs displayed novel pilus-like appendages with bundles of threads splayed at the tips. Multiple lines of evidence suggested that RBSs are bacterial and distinct from the Neisseriaceae genera Simonsiella and Conchiformibius , with which they share similar morphology and division patterning, including genomic DNA sequencing of micromanipulated RBSs, 16S rRNA gene sequencing, and fluorescence in situ hybridization. Our findings highlight the diversity of novel microbial forms and lifestyles that await discovery and characterization using tools complementary to genomics such as microscopy.

Abstract Herpesviruses remain a burden for animal and human health, including the medically important varicella-zoster virus (VZV). Membrane fusion mediated by conserved core glycoproteins, the fusogen gB and the heterodimer gH-gL, enables herpesvirus cell entry. The ectodomain of gB orthologs has five domains and is proposed to transition from a prefusion to postfusion conformation but the functional relevance of the domains for this transition remains poorly defined. Structure-function studies of the VZV gB DIII central helix were performed targeting residues 526 EHV 528 . Critically, a H527P mutation captured gB in a prefusion conformation as determined by cryo-EM, a loss of membrane fusion in a virus free assay, and failure of recombinant VZV to spread in cell monolayers. Importantly, two predominant cryo-EM structures of gB[H527P] were identified by 3D classification and focused refinement, suggesting they represented gB conformations in transition. These studies reveal gB DIII as a critical element for herpesvirus gB fusion function.

Summary Chikungunya virus (CHIKV) is an alphavirus and the etiological agent for debilitating arthritogenic disease in humans. Previous studies with purified virions or budding mutants have not resolved the structural mechanism of alphavirus assembly in situ . Here we used cryogenic electron tomography (cryoET) imaging of CHIKV-infected human cells and subvolume classification to resolve distinct assembly intermediate conformations. These structures revealed that particle formation is driven by the spike envelope layer. Additionally, we showed that asymmetric immature nucleocapsids (NCs) provide scaffolds to trigger assembly of the icosahedral spike lattice, which progressively transforms immature NCs into icosahedral cores during virus budding. Further, cryoET of the infected cells treated with neutralizing antibodies (NAbs) showed that NAb-induced blockage of CHIKV assembly was achieved by preventing spike-spike lateral interactions that are required to bend the plasma membrane around NC cores. These findings provide molecular mechanisms for designing antivirals targeting spike-driven assembly/budding of viruses.

Abstract Host cell invasion by intracellular, eukaryotic parasites within the phylum Apicomplexa, is a remarkable and active process involving the coordinated action of apical organelles and other structures. To date, capturing how these structures interact during invasion has been difficult to observe in detail. Here, we used cryogenic electron tomography to image the apical complex of Toxoplasma gondii tachyzoites under conditions that mimic resting parasites and those primed to invade through stimulation with calcium ionophore. Through the application of Mixed Scale Dense networks for image-processing, we developed a highly efficient pipeline for annotation of tomograms, enabling us to identify and extract densities of relevant subcellular organelles and accurately analyze features in 3D. The results reveal a dramatic change in the shape of the anteriorly located apical vesicle upon its apparent fusion with a rhoptry, that occurs only in the stimulated parasites. We also present information indicating that this vesicle originates from the vesicles that parallel the intraconoidal microtubules and that the latter two structures are linked by a novel tether. We show that a rosette structure previously proposed to be involved in rhoptry secretion is associated with apical vesicles beyond just the most anterior one. This result, suggesting multiple vesicles are primed to enable rhoptry secretion, may shed light on the mechanisms Toxoplasma employs to enable repeated invasion attempts. Using the same approach, we examine Plasmodium falciparum merozoites and show that they too possess an apical vesicle just beneath a rosette, demonstrating evolutionary conservation of this overall subcellular organization. Significance Statement Parasites in the phylum Apicomplexa are responsible for some of the most important parasitic diseases of humans, such as malaria and toxoplasmosis. Invasion by these obligatory, intracellular parasites depends on protein injection into the host cell. Using cryogenic electron tomography, we reveal evolutionarily conserved features shared by the invasive forms of Plasmodium falciparum and Toxoplasma gondii . By comparing resting Toxoplasma tachyzoites with those primed to invade we also gain new insight into the very first steps in invasion. For this work, we take an interdisciplinary approach, adopting a mixed-scale dense neural network that enables efficient and objective processing of the data. Combined, the results provide new information on how these important parasites accomplish the essential step of invasion.