Abstract Resistance (R) proteins recognize pathogen avirulence (Avr) proteins by direct or indirect binding and are multidomain proteins generally carrying a nucleotide binding (NB) and a leucine-rich repeat (LRR) domain. Two NB-LRR protein-coding genes from rice (Oryza sativa), RGA4 and RGA5, were found to be required for the recognition of the Magnaporthe oryzae effector AVR1-CO39. RGA4 and RGA5 also mediate recognition of the unrelated M. oryzae effector AVR-Pia, indicating that the corresponding R proteins possess dual recognition specificity. For RGA5, two alternative transcripts, RGA5-A and RGA5-B, were identified. Genetic analysis showed that only RGA5-A confers resistance, while RGA5-B is inactive. Yeast two-hybrid, coimmunoprecipitation, and fluorescence resonance energy transfer–fluorescence lifetime imaging experiments revealed direct binding of AVR-Pia and AVR1-CO39 to RGA5-A, providing evidence for the recognition of multiple Avr proteins by direct binding to a single R protein. Direct binding seems to be required for resistance as an inactive AVR-Pia allele did not bind RGA5-A. A small Avr interaction domain with homology to the Avr recognition domain in the rice R protein Pik-1 was identified in the C terminus of RGA5-A. This reveals a mode of Avr protein recognition through direct binding to a novel, non-LRR interaction domain.

Plant immunity is often triggered by the specific recognition of pathogen effectors by intracellular nucleotide-binding, leucine-rich repeat receptors (NLR). Plant NLRs contain an N-terminal signaling domain that is mostly represented by either a Toll-interleukin1 receptor (TIR) domain or a coiled coil (CC) domain. In many cases, single NLR proteins are sufficient for both effector recognition and signaling activation. However, many paired NLRs have now been identified where both proteins are required to confer resistance to pathogens. Recent detailed studies on the Arabidopsis thaliana TIR-NLR pair RRS1 and RPS4 and on the rice CC-NLR pair RGA4 and RGA5 have revealed for the first time how such protein pairs function together. In both cases, the paired partners interact physically to form a hetero-complex receptor in which each partner plays distinct roles in effector recognition or signaling activation, highlighting a conserved mode of action of NLR pairs across both monocotyledonous and dicotyledonous plants. We also describe an "integrated decoy" model for the function of these receptor complexes. In this model, a plant protein targeted by an effector has been duplicated and fused to one member of the NLR pair, where it acts as a bait to trigger defense signaling by the second NLR upon effector binding. This mechanism may be common to many other plant NLR pairs.

Abstract Intracellular nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat-containing (NLR) receptors play crucial roles in immunity across multiple domains of life. In plants, a subset of NLRs contain noncanonical integrated domains that are thought to have evolved from host targets of pathogen effectors to serve as pathogen baits. However, the functions of host proteins with similarity to NLR integrated domains and the extent to which they are targeted by pathogen effectors remain largely unknown. Here, we show that the blast fungus effector AVR-Pik binds a subset of related rice proteins containing a heavy metal-associated (HMA) domain, one of the domains that has repeatedly integrated into plant NLR immune receptors. We find that AVR-Pik binding stabilizes the rice small HMA (sHMA) proteins OsHIPP19 and OsHIPP20. Knockout of OsHIPP20 causes enhanced disease resistance towards the blast pathogen, indicating that OsHIPP20 is a susceptibility gene ( S -gene). We propose that AVR-Pik has evolved to bind HMA domain proteins and co-opt their function to suppress immunity. Yet this binding carries a trade-off, it triggers immunity in plants carrying NLR receptors with integrated HMA domains. Significance Statement Rice blast disease, caused by the fungus Magnaporthe oryzae , is one of the most devastating diseases of rice. Therefore, understanding the mechanisms of blast fungus infection and resistance of rice against the disease is important for global food security. In this study, we show that the M. oryzae effector protein AVR-PikD binds rice sHMA proteins and stabilizes them, presumably to enhance pathogen infection. We show that loss-of-function mutants in one rice sHMA, OsHIPP20, reduced the level of susceptibility against a compatible isolate of M. oryzae , suggesting that M. oryzae requires host sHMA to facilitate invasion. Remarkably, OsHIPP20 knockout rice line showed no growth defect, suggesting editing sHMA genes may present a novel source of resistance against blast disease.

SUMMARY Plant nucleotide-binding and leucine-rich repeat domain proteins (NLRs) are immune sensors that specifically recognize pathogen effectors and induce immune responses. Designing artificial NLRs with new effector recognition specificities is a promising prospect for sustainable, knowledge-driven crop protection. However, such strategies are hampered by the complexity of NLR function. Here, we tested whether molecular engineering of the integrated decoy domain (ID) of an NLR could extend its recognition spectrum to a new effector. To this aim, we relied on the detailed molecular knowledge of the recognition of distinct Magnaporthe oryzae MAX ( Magnaporthe AVRs and ToxB-like) effectors by the rice NLRs RGA5 and Pikp-1. For both NLRs, effector recognition involves physical binding to their HMA (Heavy Metal-Associated) IDs. However, AVR-PikD, the effector recognized by Pikp-1, binds to a completely different surface of the HMA domain compared to AVR-Pia and AVR1-CO39, recognized by RGA5. By introducing into the HMA domain of RGA5 the residues of the Pikp-1 HMA domain involved in AVR-PikD binding, we created a high-affinity binding surface for this new effector. In the Nicotiana benthamiana heterologous system, RGA5 variants carrying this engineered binding surface still recognize AVR-Pia and AVR1-CO39, but also perceive the new ligand, AVR-PikD, resulting in the activation of immune responses. Therefore, our study provides a proof of concept for the design of new effector recognition specificities in NLRs through molecular engineering of IDs. However, it pinpoints significant knowledge gaps that limit the full deployment of this NLR-ID engineering strategy and provides hypotheses for future research on this topic.

ABSTRACT Plant pathogens secrete proteins called effectors that target host cellular processes to promote disease. Recently, structural genomics has identified several families of fungal effectors that share a similar three-dimensional structure despite remarkably variable amino-acid sequences and surface properties. To explore the selective forces that underlie the sequence variability of structurally-analogous effectors, we focused on MAX effectors, a structural family of effectors that are major determinants of virulence in the rice blast fungus Pyricularia oryzae . Using structure-informed gene annotation, we identified 58 to 78 MAX effector genes per genome in a set of 120 isolates representing seven host-associated lineages. The expression of MAX effector genes was primarily restricted to the early biotrophic phase of infection and strongly influenced by the host plant. Pangenome analyses of MAX effectors demonstrated extensive presence/absence polymorphism and identified gene loss events possibly involved in host range adaptation. However, gene knock-in experiments did not reveal a strong effect on virulence phenotypes suggesting that other evolutionary mechanisms are the main drivers of MAX effector losses. MAX effectors displayed high levels of standing variation and high rates of non-synonymous substitutions, pointing to widespread positive selection shaping the molecular diversity of MAX effectors. The combination of these analyses with structural data revealed that positive selection acts mostly on residues located in particular structural elements and at specific positions. By providing a comprehensive catalog of amino acid polymorphism, and by identifying the structural determinants of the sequence diversity, our work will inform future studies aimed at elucidating the function and mode of action of MAX effectors. AUTHOR SUMMARY Fungal plant pathogens use small secreted proteins, called effectors, to manipulate to their own advantage their host’s physiology and immunity. The evolution of these effectors, whether spontaneously or in response to human actions, can lead to epidemics or the emergence of new diseases. It is therefore crucial to understand the mechanisms underlying this evolution. In this article, we report on the evolution of effectors in one of the prime experimental model systems of plant pathology, Pyricularia oryzae , the fungus causing blast diseases in rice, wheat, and other cereals or grasses. We further characterize in this fungus a particular class of effectors, called MAX effectors, using structural models based on experimental protein structures of effectors. We show that this class of effector is produced by the pathogen during the early stages of infection, when plant cells are still alive. By comparing the gene content of isolates infecting different plant species, we show that the MAX effector arsenal is highly variable from one isolate to another. Finally, using the inferential framework of population genetics, we demonstrate that MAX effectors exhibit very high genetic variability and that this results from the action of natural selection.

Plant pathogenic fungi secrete a wide variety of small proteins, named effectors. Magnaporthe AVRs and ToxB-like (MAX) effectors constitute a superfamily of secreted proteins widely distributed in Pyricularia (syn. Magnaporthe) oryzae, a devastating fungus responsible for blast disease in cereals such as rice. In spite of high evolutionary sequence divergence, MAX effectors share a common fold characterized by a β-sandwich core often stabilized by a conserved disulfide bond. In this study, we investigated the structural landscape and diversity within this effector family based on a previous phylogenetic analysis of P. oryzae protein sequences that identified 94 ortholog groups (OG) of putative MAX effectors. Combining protein structure modeling approaches and experimental structure determination, we validated the prediction of the conserved MAX core domain for 77 OG clusters. Four novel MAX effector structures determined by NMR were in remarkably good agreement with AlphaFold2 (AF) predictions. Based on the comparison of the AF-generated 3D models we propose an updated classification of the MAX effectors superfamily in 20 structural groups that highlight variation observed in the canonical MAX fold, disulfide bond patterns and decorating secondary structures in N- and C-terminal extensions. About one-third of the MAX family members remain single, showing no obvious structural relationship with other MAX effectors. Analysis of the surface properties of the AF MAX models also highlights the very high variability remaining within the MAX family when examined at the structural level, probably reflecting the wide diversity of their virulence functions and host targets.

Summary Arabidopsis basal immunity depends on cooperation between EDS1-PAD4 dimers and ADR1-family helper NLRs to limit pathogen infection. We investigated the genetic and functional relationships of rice ( Oryza sativa ) EDS1, PAD4 and ADR1 orthologs in disease resistance. Single and combinatorial eds1 , pad4 and adr1 CRISPR/Cas9 mutants were generated in O. sativa ssp . japonica varieties Kitaake and Zhonghua 11. Growth, physiological fitness and disease resistance phenotypes were assessed together with RNA expression and phytohormone profiles. Contributions of EDS1 , PAD4 and ADR1 to resistance against fungal and bacterial pathogens suggest these components also cooperate in promoting rice basal immunity. However, combined loss of EDS1 with PAD4 leads to ADR1 -dependent reduced growth and fitness of rice plants accompanied by constitutively high salicylic acid accumulation and enhanced resistance. The eds1 pad4 double mutant displays features of imbalanced defense - nutrient homeostasis. Data reveal both cooperative and antagonistic EDS1 , PAD4 and ADR1 activities in rice. In pathogen-challenged rice plants, EDS1-PAD4-ADR1 likely function together as a module conferring basal immunity. In pathogen-unchallenged plants, EDS1 and PAD4 individually constrain ADR1 activity, thereby suppressing immune responses and maintaining fitness. ADR1 -dependent autoimmunity in rice eds1 pad4 plants indicates a different mode of ADR1 recruitment and action than via EDS1-PAD4.