BackgroundAn important feature of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 pathogenesis is COVID-19-associated coagulopathy, characterised by increased thrombotic and microvascular complications. Previous studies have suggested a role for endothelial cell injury in COVID-19-associated coagulopathy. To determine whether endotheliopathy is involved in COVID-19-associated coagulopathy pathogenesis, we assessed markers of endothelial cell and platelet activation in critically and non-critically ill patients admitted to the hospital with COVID-19.MethodsIn this single-centre cross-sectional study, hospitalised adult (≥18 years) patients with laboratory-confirmed COVID-19 were identified in the medical intensive care unit (ICU) or a specialised non-ICU COVID-19 floor in our hospital. Asymptomatic, non-hospitalised controls were recruited as a comparator group for biomarkers that did not have a reference range. We assessed markers of endothelial cell and platelet activation, including von Willebrand Factor (VWF) antigen, soluble thrombomodulin, soluble P-selectin, and soluble CD40 ligand, as well as coagulation factors, endogenous anticoagulants, and fibrinolytic enzymes. We compared the level of each marker in ICU patients, non-ICU patients, and controls, where applicable. We assessed correlations between these laboratory results with clinical outcomes, including hospital discharge and mortality. Kaplan–Meier analysis was used to further explore the association between biochemical markers and survival.Findings68 patients with COVID-19 were included in the study from April 13 to April 24, 2020, including 48 ICU and 20 non-ICU patients, as well as 13 non-hospitalised, asymptomatic controls. Markers of endothelial cell and platelet activation were significantly elevated in ICU patients compared with non-ICU patients, including VWF antigen (mean 565% [SD 199] in ICU patients vs 278% [133] in non-ICU patients; p<0·0001) and soluble P-selectin (15·9 ng/mL [4·8] vs 11·2 ng/mL [3·1]; p=0·0014). VWF antigen concentrations were also elevated above the normal range in 16 (80%) of 20 non-ICU patients. We found mortality to be significantly correlated with VWF antigen (r = 0·38; p=0·0022) and soluble thrombomodulin (r = 0·38; p=0·0078) among all patients. In all patients, soluble thrombomodulin concentrations greater than 3·26 ng/mL were associated with lower rates of hospital discharge (22 [88%] of 25 patients with low concentrations vs 13 [52%] of 25 patients with high concentrations; p=0·0050) and lower likelihood of survival on Kaplan–Meier analysis (hazard ratio 5·9, 95% CI 1·9–18·4; p=0·0087).InterpretationOur findings show that endotheliopathy is present in COVID-19 and is likely to be associated with critical illness and death. Early identification of endotheliopathy and strategies to mitigate its progression might improve outcomes in COVID-19.FundingThis work was supported by a gift donation from Jack Levin to the Benign Hematology programme at Yale, and the National Institutes of Health.

Apoptosis is a form of programmed cell death that is controlled by aspartate-specific cysteine proteases called caspases. In the immune system, apoptosis counters the proliferation of lymphocytes to achieve a homeostatic balance, which allows potent responses to pathogens but avoids autoimmunity1,2. The CD95 (Fas, Apo-1) receptor triggers lymphocyte apoptosis by recruiting Fas-associated death domain (FADD), caspase-8 and caspase-10 proteins into a death-inducing signalling complex3,4. Heterozygous mutations in CD95, CD95 ligand or caspase-10 underlie most cases of autoimmune lymphoproliferative syndrome (ALPS), a human disorder that is characterized by defective lymphocyte apoptosis, lymphadenopathy, splenomegaly and autoimmunity5,6,7,8,9,10,11,12,13,14. Mutations in caspase-8 have not been described in ALPS, and homozygous caspase-8 deficiency causes embryonic lethality in mice. Here we describe a human kindred with an inherited genetic deficiency of caspase-8. Homozygous individuals manifest defective lymphocyte apoptosis and homeostasis but, unlike individuals affected with ALPS, also have defects in their activation of T lymphocytes, B lymphocytes and natural killer cells, which leads to immunodeficiency. Thus, caspase-8 deficiency in humans is compatible with normal development and shows that caspase-8 has a postnatal role in immune activation of naive lymphocytes.

A role for caspase-10, previously implicated in the autoimmune lymphoproliferative syndrome, in death receptor signaling has not been directly shown. Here we show that caspase-10 can function independently of caspase-8 in initiating Fas- and tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-receptor-mediated apoptosis. Moreover, Fas crosslinking in primary human T cells leads to the recruitment and activation of caspase-10. Fluorescent resonance energy transfer analysis indicates that the death-effector domains of caspase-8 and -10 both interact with the death-effector domain of FADD. Nonetheless, we find that caspase-8 and -10 may have different apoptosis substrates and therefore potentially distinct roles in death receptor signaling or other cellular processes.

ABSTRACT Complement activation has been implicated in the pathogenesis of severe SARS-CoV-2 infection. However, it remains to be determined whether increased complement activation is a broad indicator of critical illness (and thus, no different in COVID-19). It is also unclear which pathways are contributing to complement activation in COVID-19, and, if complement activation is associated with certain features of severe SARS-CoV-2 infection, such as endothelial injury and hypercoagulability. To address these questions, we investigated complement activation in the plasma from patients with COVID-19 prospectively enrolled at two tertiary care centers. We compared our patients to two non-COVID cohorts: (a) patients hospitalized with influenza, and (b) patients admitted to the intensive care unit (ICU) with acute respiratory failure requiring invasive mechanical ventilation (IMV). We demonstrate that circulating markers of complement activation (i.e., sC5b-9) are elevated in patients with COVID-19 compared to those with influenza and to patients with non-COVID-19 respiratory failure. Further, the results facilitate distinguishing those who are at higher risk of worse outcomes such as requiring ICU admission, or IMV. Moreover, the results indicate enhanced activation of the alternative complement pathway is most prevalent in patients with severe COVID-19 and is associated with markers of endothelial injury (i.e., Ang2) as well as hypercoagulability (i.e., thrombomodulin and von Willebrand factor). Our findings identify complement activation to be a distinctive feature of COVID-19, and provide specific targets that may be utilized for risk prognostication, drug discovery and personalized clinical trials. SUMMMARY Complement has been implicated in COVID-19. However, whether this is distinctive of COVID-19 remains unanswered. Ma et al report increased complement activation in COVID-19 compared to influenza and non-COVID respiratory failure, and demonstrate alternative pathway activation as a key marker of multiorgan failure and death.

ABSTRACT Rationale Modulation of endothelial cell behavior and phenotype by hemodynamic forces involves many signaling components, including cell surface receptors, intracellular signaling intermediaries, transcription factors, and epigenetic elements. Many of the signaling mechanisms that underlie mechanotransduction by endothelial cells are inadequately defined. Objective We sought to better understand how β-arrestins, intracellular proteins that regulate agonist-mediated desensitization and integration of signaling by transmembrane receptors, may be involved in the endothelial cell response to shear stress. Methods and Results In vitro studies with primary endothelial cells subjected to β-arrestin knockdown, and in vivo studies using mice with endothelial specific deletion of β-arrestin 1 and β-arrestin 2 were conducted. We found that β-arrestins are localized to primary cilia in endothelial cells, which are present in subpopulations of endothelial cells in relatively low shear states. Recruitment of β-arrestins to cilia involved its interaction with IFT81, a component of the flagellar transport protein complex in the cilia. β-arrestin knockdown led to marked reduction in shear stress response, including induction of NOS3 expression. Within the cilia, β-arrestins were found to associate with the type II bone morphogenetic protein receptor (BMPR-II), whose disruption similarly led to an impaired endothelial shear response. β-arrestins also regulated Smad transcription factor phosphorylation by BMPR-II. Mice with endothelial specific deletion of β-arrestin 1 and β-arrestin 2 were found to have impaired retinal angiogenesis. Conclusion We have identified a novel role for endothelial β-arrestins as key transducers of ciliary mechanotransduction that play a central role in shear signaling by BMPR-II and contribute to vascular development. NOVELTY AND SIGNIFICANCE What Is Known? Endothelial cells respond to flow-induced shear stress with biochemical changes, such as phosphorylation of endothelial nitric oxide synthase, that promote morphological changes, such as cell alignment. The endothelial response to shear stress can involve primary cilia, microtubule-based sensory organelles that detect extracellular stimuli and generates intracellular signals. The specific ciliary signaling pathways that regulate endothelial mechanotransduction have not been fully elucidated. What New Information Does This Article Contribute? β-arrestins directly interact with the ciliary protein intraflagellar transport protein 81 (IFT81), which is present in the primary cilia of endothelial cells, and are required for the morphological response to flow-induced shear stress. β-arrestins regulates type II bone morphogenetic protein receptor signaling, which is required for the endothelial response to shear stress, and is required for the phosphorylation of Smad transcription factors. β-arrestins are required for endothelial nitric oxide synthase-mediated flow-induced shear stress response in endothelial cells. Endothelial cell-specific knockout of β-arrestins results in abnormal vascular development, with a loss of vessel length and branchpoints.

ABSTRACT Introduction More than 300,000 patients are placed on mechanical ventilation in the ICU annually in the United States. Many of these patients will require hyperoxia (>70% oxygen) to prevent tissue hypoxia. We have previously shown that the tyrosine kinase receptor epidermal growth factor receptor (EGFR) regulates alveolar epithelial apoptosis in hyperoxia. Mice with reduced total EGFR activity (EGFR Wa5/+ mice) show improved survival and reduced markers of ALI compared with WT in hyperoxia. How EGFR regulates additional cell death pathways in hyperoxia remains to be explored. Methods We tested the hypothesis that EGFR regulates the molecule coiled-coil moesin-like BCL2-interacting protein (Beclin-1 [BCN1]), which is known to induce autophagy, in hyperoxia. Effects of 100% oxygen were studied in EGFR Wa5/+ mice and wildtype (WT) littermates. Mice were exposed to 100% oxygen for 24, 48, and 72 hours and compared with normoxia controls. Lungs were analyzed for BCN1 via Western blot (WB), RT-qPCR, immunohistochemistry (IHC), and flow cytometry. Whole-lung and cell-specific analyses were completed. The specific BCN1 phosphorylation site (p-BCN1), serine residue 91 and 94 (Ser91, −94) for mouse (Ser93, −96 for human), that regulates autophagy was examined. Results In WT mice, hyperoxia induced increased whole-lung BCN1 compared with normoxia via WB and RT-qPCR. Whole-lung and epithelial-specific p-BCN1 was increased compared with normoxia via IHC and flow cytometry. Hyperoxia led to increased autophagy via WB and RT-qPCR. EGFR Wa5/+ mice showed increased BCN1 and reduced p-/total BCN1 ratios in hyperoxia compared with WT via WB. EGFR Wa5/+ mice also showed increased BCN1 via RT-qPCR and decreased epithelial-specific p-/total BCN1 ratios via flow cytometry, although this did not reach statistical significance. EGFR Wa5/+ mice showed reduced autophagy via WB compared with WT in hyperoxia. Conclusions Hyperoxia induced increased whole-lung and epithelial-specific BCN1 in hyperoxia and resulted in increased autophagy. Decreased EGFR activity, which leads to improved survival in hyperoxia, resulted in decreased whole-lung p-/total BCN1 ratios and decreased epithelial-specific p-/total BCN1 ratios in hyperoxia in vivo . Because BCN1 and autophagy can regulate cell death, EGFR regulation of p-BCN1 and autophagy is a mechanism in hyperoxia with therapeutic potential.