The enhancer-binding protein AP-1 has been purified to >95% homogeneity from HeLa cells by sequence-specific DNA affinity chromatography and identified as a 47 kd polypeptide. Purified AP-1 activates transcription in vitro of the wild-type human metallothionein IIA (hMT IIA) gene but not mutant hMT IIA promoters lacking AP-1 recognition sites. DNAase I protection analysis indicates that genetically defined enhancer elements in hMT IIA, SV40, and the human collagenase gene contain high-affinity AP-1-binding sites, each with a conserved recognition motif, TGACTCA. These three genes are transcriptionally induced by treatment of cells with the tumor promoter TPA. Here we demonstrate that multiple synthetic copies of the consensus AP-1-binding site can act as TPA-inducible enhancers in various plasmid constructs after transfection into HeLa cells. These findings suggest that AP-1 is a transcription factor that functions by interacting with a specific enhancer element, and that its activities may be modulated by treatment of cells with TPA, known to stimulate protein kinase C.

Transcription factor Sp1 is a protein present in mammalian cells that binds to GC box promoter elements and selectively activates mRNA synthesis from genes that contain functional recognition sites. We have isolated a cDNA that encodes the 696 C-terminal amino acid residues of human Sp1. By expression of truncated fragments of Sp1 in E. coli, we have localized the DNA binding activity to the C-terminal 168 amino acid residues. In this region, Sp1 has three contiguous Zn(II) finger motifs, which are believed to be metalloprotein structures that interact with DNA. We have found that purified Sp1 requires Zn(II) for sequence-specific binding to DNA. Thus, it is likely that Sp1 interacts with DNA by binding of the Zn(II) fingers. To facilitate the identification of mutant variants of Sp1 that are defective in DNA binding, we have also devised a bacterial colony assay for detection of Sp1 binding to DNA.

The biochemical analysis of cellular trans-activators involved in promoter recognition provides an important step toward understanding the mechanisms of gene expression in animal cells. The promoter selective transcription factor, Sp1, has been purified from human cells to more than 95 percent homogeneity by sequence-specific DNA affinity chromatography. Isolation and renaturation of proteins purified from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels allowed the identification of two polypeptides (105 and 95 kilodaltons) as those responsible for recognizing and interacting specifically with the GC-box promoter elements characteristic of Sp1 binding sites.

Fractionation of HeLa cell extracts reveals the presence of a promoter-specific transcription factor, Sp 1, which activates a class of promoters that includes the SV40 early promoter but not several others that have been tested. We analyzed SV40 early-promoter deletion mutants and determined that transcriptional activation by Sp 1 requires sequences within tandem 21 bp repeats located 70-110 bp upstream of the transcription initiation sites. In a DNAase footprinting assay, Sp 1 protected sequences in this same 21 bp repeat region, thus indicating the presence of a specific site for Sp 1 binding. During purification of Sp 1, there was a correlation between transcription-stimulatory activity and promoter-binding activity. These results suggest that direct binding of Sp 1 to sequences in the upstream promoter element is the mechanism by which this factor activates transcription by RNA polymerase II at the SV40 early promoter.

We have adopted Drosophila tissue culture cells as a host system for studying the structure and function of mammalian transcription factors. These cells provide an Sp1-deficient background and have been used in a complementation assay to identify functional domains of human transcription factor Sp1. The SV40 early promoter, which contains six Sp1 binding sites (GC boxes), is induced up to 500-fold in Drosophila cells by the expression of Sp1, whereas promoters with fewer sites are activated less efficiently. Analysis of Sp1 mutants reveals multiple distinct regions outside of the DNA binding domain that are responsible for mediating transcriptional activation. The two most active domains, which appear to be functionally redundant with one another, consist of an unusual structure with a very low charge density, but a strikingly high glutamine content. A number of other sequence-specific transcription factors, such as the Drosophila zeste protein and several homeodomain proteins, contain glutamine-rich stretches, and we propose that these glutamine-rich domains represent a novel structural motif for transcriptional activation.

We describe a method for affinity purification of sequence-specific DNA binding proteins that is fast and effective. Complementary chemically synthesized oligodeoxynucleotides that contain a recognition site for a sequence-specific DNA binding protein are annealed and ligated to give oligomers. This DNA is then covalently coupled to Sepharose CL-2B with cyanogen bromide to yield the affinity resin. A partially purified protein fraction is combined with competitor DNA and subsequently passed through the DNA-Sepharose resin. The desired sequence-specific DNA binding protein is purified because it preferentially binds to the recognition sites in the affinity resin rather than to the nonspecific competitor DNA in solution. For example, a protein fraction that is enriched for transcription factor Sp1 can be further purified 500- to 1000-fold by two sequential affinity chromatography steps to give Sp1 of an estimated 90% homogeneity with 30% yield. In addition, the use of tandem affinity columns containing different protein binding sites allows the simultaneous purification of multiple DNA binding proteins from the same extract. This method provides a means for the purification of rare sequence-specific DNA binding proteins, such as Sp1 and CAAT-binding transcription factor.

Choanoflagellates are the closest known relatives of metazoans. To discover potential molecular mechanisms underlying the evolution of metazoan multicellularity, we sequenced and analysed the genome of the unicellular choanoflagellate Monosiga brevicollis. The genome contains approximately 9,200 intron-rich genes, including a number that encode cell adhesion and signalling protein domains that are otherwise restricted to metazoans. Here we show that the physical linkages among protein domains often differ between M. brevicollis and metazoans, suggesting that abundant domain shuffling followed the separation of the choanoflagellate and metazoan lineages. The completion of the M. brevicollis genome allows us to reconstruct with increasing resolution the genomic changes that accompanied the origin of metazoans. The genome sequence of the marine choanoflagellate Monosiga brevicollis has now been determined. Choanoflagellates are a mainly sessile group of protozoa resembling the 'feeding cells' of sponges, and are considered to be the closest living unicellular relatives of multicellular animals. Comparison of the M. brevicollis sequence with metazoan genomes suggests that the last unicellular ancestor of animals had intron-rich genes, some encoding protein domains characteristically associated with cell adhesion and the extracellular matrix in animals. This organism is strictly unicellular, but other choanoflagellates form colonies and may provide clues as to the origin of cell signalling and other systems in early metazoans.

The RNA polymerase II transcription factor Sp1 is a protein that binds to specific DNA sequences and activates RNA synthesis from a select group of promoters. Sp1 and related factors appear to be important for modulation of gene expression in higher organisms.

In reconstituted reactions, Sp1 stimulates transcription at TATA-containing promoters in the presence of semipurified TFIID fractions from either human or Drosophila cells, but is unable to do so when these fractions are replaced by purified, cloned Drosophila or yeast TFIID. Our findings with Sp1 and CTF suggest that partially purified TFIID fractions from human and Drosophila cells contain coactivators that are dispensable for basal transcription but are required as molecular adaptors between trans-activators and the general transcription initiation machinery. Experiments using cloned TFIID proteins suggest that these coactivators function through the amino-terminal portion of TFIID and that coactivator-TFIID interactions are species specific. At promoters lacking a TATA box, an additional activity distinct from coactivators is required for Sp1 activation of transcription.