Data-independent acquisition modes isolate and concurrently fragment populations of different precursors by cycling through segments of a predefined precursor m/z range. Although these selection windows collectively cover the entire m/z range, overall, only a few per cent of all incoming ions are isolated for mass analysis. Here, we make use of the correlation of molecular weight and ion mobility in a trapped ion mobility device (timsTOF Pro) to devise a scan mode that samples up to 100% of the peptide precursor ion current in m/z and mobility windows. We extend an established targeted data extraction workflow by inclusion of the ion mobility dimension for both signal extraction and scoring and thereby increase the specificity for precursor identification. Data acquired from whole proteome digests and mixed organism samples demonstrate deep proteome coverage and a high degree of reproducibility as well as quantitative accuracy, even from 10 ng sample amounts. diaPASEF makes use of the correlation between the ion mobility and the m/z of peptides to trap and release precursor ions in a TIMS-TOF mass spectrometer for an almost complete sampling of the precursor ion beam with data-independent acquisition.

Reproducibility in research can be compromised by both biological and technical variation, but most of the focus is on removing the latter. Here we investigate the effects of biological variation in HeLa cell lines using a systems-wide approach. We determine the degree of molecular and phenotypic variability across 14 stock HeLa samples from 13 international laboratories. We cultured cells in uniform conditions and profiled genome-wide copy numbers, mRNAs, proteins and protein turnover rates in each cell line. We discovered substantial heterogeneity between HeLa variants, especially between lines of the CCL2 and Kyoto varieties, and observed progressive divergence within a specific cell line over 50 successive passages. Genomic variability has a complex, nonlinear effect on transcriptome, proteome and protein turnover profiles, and proteotype patterns explain the varying phenotypic response of different cell lines to Salmonella infection. These findings have implications for the interpretation and reproducibility of research results obtained from human cultured cells. Systems-wide analysis of HeLa cell lines from 13 labs identifies substantial molecular and phenotypic variability.

ABSTRACT In common with other omics technologies, mass spectrometry (MS)-based proteomics produces ever-increasing amounts of raw data, making their efficient analysis a principal challenge. There is a plethora of different computational tools that process the raw MS data and derive peptide and protein identification and quantification. During the last decade, there has been dramatic progress in computer science and software engineering, including collaboration tools that have transformed research and industry. To leverage these advances, we developed AlphaPept, a Python-based open-source framework for efficient processing of large high-resolution MS data sets. Using Numba for just-in-time machine code compilation on CPU and GPU, we achieve hundred-fold speed improvements while maintaining clear syntax and rapid development speed. AlphaPept uses the Python scientific stack of highly optimized packages, reducing the code base to domain-specific tasks while providing access to the latest advances in machine learning. We provide an easy on-ramp for community validation and contributions through the concept of literate programming, implemented in Jupyter Notebooks of the different modules. A framework for continuous integration, testing, and benchmarking enforces solid software engineering principles. Large datasets can rapidly be processed as shown by the analysis of hundreds of cellular proteomes in minutes per file, many-fold faster than the data acquisiton. The AlphaPept framework can be used to build automated processing pipelines using efficient HDF5 based file formats, web-serving functionality and compatibility with downstream analysis tools. Easy access for end-users is provided by one-click installation of the graphical user interface, for advanced users via a modular Python library, and for developers via a fully open GitHub repository.

Abstract Single-cell proteomics aims to characterize biological function and heterogeneity at the level of proteins in an unbiased manner. It is currently limited in proteomic depth, throughput and robustness, a challenge that we address here by a streamlined multiplexed workflow using data-independent acquisition (mDIA). We demonstrate automated and complete dimethyl labeling of bulk or single-cell samples, without losing proteomic depth. In single runs of mammalian cells, a three-plex analysis of tryptic peptides quantified 7,700 proteins per channel. The Lys-N enzyme enables five-plex quantification at MS1 and MS2 level. Because the multiplex channels are quantitatively isolated from each other, mDIA accommodates a reference channel that does not interfere with the target channels. Our algorithm RefQuant takes advantage of this feature and confidently quantifies close to 4,000 proteins in single cells with excellent reproducibility, while our workflow currently allows routine analysis of 80 single cells per day. The concept of a stable proteome still holds at this deeper proteome coverage.

Proteins are major effectors and regulators of biological processes that can elicit multiple functions depending on their interaction with other proteins. The organization of proteins into macromolecular complexes and their quantitative distribution across these complexes is, therefore, of great biological and clinical significance. In this paper we describe an integrated experimental and computational technique to quantify hundreds of protein complexes in a single operation. The method consists of size exclusion chromatography (SEC) to fractionate native protein complexes, SWATH/DIA mass spectrometry to precisely quantify the proteins in each SEC fraction and the computational framework CCprofiler to detect and quantify protein complexes by error-controlled, complex-centric analysis using prior information from generic protein interaction maps. Our analysis of the HEK293 cell line proteome delineates 462 complexes composed of 2127 protein subunits. The technique identifies novel subcomplexes and assembly intermediates of central regulatory complexes while assessing the quantitative subunit distribution across them. We make the toolset CCprofiler freely accessible, and provide a web platform, SECexplorer, for custom exploration of the HEK293 proteome modularity.

Abstract Mitochondria are essential organelles involved in critical biological processes such as energy metabolism and cell survival. Their dysfunction is linked to numerous human pathologies that often manifest in a tissue-specific manner. Accordingly, mitochondrial fitness depends on versatile proteomes specialized to meet diverse tissue-specific requirements. Furthermore, increasing evidence suggests that phosphorylation may also play an important role in regulating tissue-specific mitochondrial functions and pathophysiology. We hypothesized that recent advances in mass spectrometry (MS)-based proteomics would now enable in-depth measurement to quantitatively profile mitochondrial proteomes along with their matching phosphoproteomes across tissues. We isolated mitochondria from mouse heart, skeletal muscle, brown adipose tissue, kidney, liver, brain, and spleen by differential centrifugation followed by separation on Percoll gradients and high-resolution MS analysis of the proteomes and phosphoproteomes. This in-depth map substantially quantifies known and predicted mitochondrial proteins and provides a resource of core and tissue modulated mitochondrial proteins ( mitophos.de ). We also uncover tissue-specific repertoires of dozens of kinases and phosphatases. Predicting kinase substrate associations for different mitochondrial compartments indicates tissue-specific regulation at the phosphoproteome level. Illustrating the functional value of our resource, we reproduce mitochondrial phosphorylation events on DRP1 responsible for its mitochondrial recruitment and fission initiation and describe phosphorylation clusters on MIGA2 linked to mitochondrial fusion.

Nearly all cellular functions are mediated by protein-protein interactions and mapping the interactome provides fundamental insights into the regulation and structure of biological systems. In principle, affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) is an ideal and scalable tool, however, it has been difficult to identify low copy number complexes, membrane complexes and those disturbed by protein-tagging. As a result, our current knowledge of the interactome is far from complete, and assessing the reliability of reported interactions is challenging. Here we develop a sensitive, high-throughput, and highly reproducible AP-MS technology combined with a quantitative two-dimensional analysis strategy for comprehensive interactome mapping of Saccharomyces cerevisiae . We reduced required cell culture volumes thousand-fold and employed 96-well formats throughout, allowing replicate analysis of the endogenous green fluorescent protein (GFP) tagged library covering the entire expressed yeast proteome. The 4159 pull-downs generated a highly structured network of 3,909 proteins connected by 29,710 interactions. Compared to previous large-scale studies, we double the number of proteins (nodes in the network) and triple the number of reliable interactions (edges), including very low abundant epigenetic complexes, organellar membrane complexes and non-taggable complexes interfered by abundance correlation. This nearly saturated interactome reveals that the vast majority of yeast proteins are highly connected, with an average of 15 interactors, the majority of them unreported so far. Similar to social networks between humans, the average shortest distance is 4.2 interactions. A web portal ( www.yeast-interactome.org ) enables exploration of our dataset by the network and biological communities and variations of our AP-MS technology can be employed in any organism or dynamic conditions.

SUMMARY Protein ubiquitination is involved in virtually all cellular processes. Enrichment strategies employing antibodies targeting ubiquitin-derived diGly remnants combined with mass spectrometry (MS) have enabled investigations of ubiquitin signaling at a large scale. However, so far the power of data independent acquisition (DIA) with regards to sensitivity in single run analysis and data completeness have not yet been explored. We developed a sensitive workflow combining diGly antibody-based enrichment and optimized Orbitrap-based DIA with comprehensive spectral libraries together containing more than 90,000 diGly peptides. This approach identified 35,000 diGly peptides in single measurements of proteasome inhibitor-treated cells – double the number and quantitative accuracy of data dependent acquisition. Applied to TNF-alpha signaling, the workflow comprehensively captured known sites while adding many novel ones. A first systems-wide investigation of ubiquitination of the circadian cycle uncovered hundreds of cycling ubiquitination sites and dozens of cycling ubiquitin clusters within individual membrane protein receptors and transporters, highlighting novel connections between metabolism and circadian regulation.

Abstract The recent revolution in computational protein structure prediction provides folding models for entire proteomes, which can now be integrated with large-scale experimental data. Mass spectrometry (MS)-based proteomics has identified and quantified tens of thousands of post-translational modifications (PTMs), most of them of uncertain functional relevance. In this study, we determine the structural context of these PTMs and investigate how this information can be leveraged to pinpoint potential regulatory sites. Our analysis uncovers global patterns of PTM occurrence across folded and intrinsically disordered regions. We found that this information can help to distinguish regulatory PTMs from those marking improperly folded proteins. Interestingly, the human proteome contains thousands of proteins that have large folded domains linked by short, unstructured regions that are strongly enriched in regulatory phosphosites. These include well-known kinase activation loops that induce protein conformational changes upon phosphorylation. This regulatory mechanism appears to be widespread in kinases but also occurs in other protein families such as solute carriers. It is not limited to phosphorylation but includes ubiquitination and acetylation sites as well. Furthermore, we performed three-dimensional proximity analysis which revealed examples of spatial co-regulation of different PTM types and potential PTM crosstalk. To enable the community to build upon these first analyses, we provide tools for 3D visualization of proteomics data and PTMs as well as python libraries for data accession and processing.

Abstract Protein complexes constitute the primary functional modules of cellular activity. To respond to perturbations, complexes undergo changes in their abundance, subunit composition or state of modification. Understanding the function of biological systems requires global strategies to capture this contextual state information on protein complexes and interaction networks. Methods based on co-fractionation paired with mass spectrometry have demonstrated the capability for deep biological insight but the scope of studies using this approach has been limited by the large measurement time per biological sample and challenges with data analysis. As such, there has been little uptake of this strategy beyond a few expert labs into the broader life science community despite rich biological information content. We present a rapid integrated experimental and computational workflow to assess the re-organization of protein complexes across multiple cellular states. It enables complex experimental designs requiring increased sample/condition numbers. The workflow combines short gradient chromatography and DIA/SWATH mass spectrometry with a data analysis toolset to quantify changes in complex organization. We applied the workflow to study the global protein complex rearrangements of THP-1 cells undergoing monocyte to macrophage differentiation and a subsequent stimulation of macrophage cells with lipopolysaccharide. We observed massive proteome organization in functions related to signaling, cell adhesion, and extracellular matrix during differentiation, and less pronounced changes in processes related to innate immune response induced by the macrophage stimulation. We therefore establish our integrated differential pipeline for rapid and state-specific profiling of protein complex organization with broad utility in complex experimental designs.