Abstract Rheumatoid arthritis is a prototypical autoimmune disease that causes joint inflammation and destruction 1 . There is currently no cure for rheumatoid arthritis, and the effectiveness of treatments varies across patients, suggesting an undefined pathogenic diversity 1,2 . Here, to deconstruct the cell states and pathways that characterize this pathogenic heterogeneity, we profiled the full spectrum of cells in inflamed synovium from patients with rheumatoid arthritis. We used multi-modal single-cell RNA-sequencing and surface protein data coupled with histology of synovial tissue from 79 donors to build single-cell atlas of rheumatoid arthritis synovial tissue that includes more than 314,000 cells. We stratified tissues into six groups, referred to as cell-type abundance phenotypes (CTAPs), each characterized by selectively enriched cell states. These CTAPs demonstrate the diversity of synovial inflammation in rheumatoid arthritis, ranging from samples enriched for T and B cells to those largely lacking lymphocytes. Disease-relevant cell states, cytokines, risk genes, histology and serology metrics are associated with particular CTAPs. CTAPs are dynamic and can predict treatment response, highlighting the clinical utility of classifying rheumatoid arthritis synovial phenotypes. This comprehensive atlas and molecular, tissue-based stratification of rheumatoid arthritis synovial tissue reveal new insights into rheumatoid arthritis pathology and heterogeneity that could inform novel targeted treatments.

Summary Rheumatoid arthritis (RA) is a prototypical autoimmune disease that causes destructive tissue inflammation in joints and elsewhere. Clinical challenges in RA include the empirical selection of drugs to treat patients, inadequate responders with incomplete disease remission, and lack of a cure. We profiled the full spectrum of cells in inflamed synovium from patients with RA with the goal of deconstructing the cell states and pathways characterizing pathogenic heterogeneity in RA. Our multicenter consortium effort used multi-modal CITE-seq, RNA-seq, and histology of synovial tissue from 79 donors to build a >314,000 single-cell RA synovial cell atlas with 77 cell states from T, B/plasma, natural killer, myeloid, stromal, and endothelial cells. We stratified tissue samples into six distinct cell type abundance phenotypes (CTAPs) individually enriched for specific cell states. These CTAPs demonstrate the striking diversity of RA synovial inflammation, ranging from marked enrichment of T and B cells (CTAP-TB) to a congregation of specific myeloid, fibroblast, and endothelial cells largely lacking lymphocytes (CTAP-EFM). Disease-relevant cytokines, histology, and serology metrics are associated with certain CTAPs. This comprehensive RA synovial atlas and molecular, tissue-based CTAP stratification reveal new insights into RA pathology and heterogeneity, which could lead to novel targeted-treatment approaches in RA.

Abstract Background Detailed molecular analyses of cells from rheumatoid arthritis (RA) synovium hold promise in identifying cellular phenotypes that drive tissue pathology and joint damage. The Accelerating Medicines Partnership (AMP) RA/SLE network aims to deconstruct autoimmune pathology by examining cells within target tissues through multiple high-dimensional assays. Robust standardized protocols need to be developed before cellular phenotypes at a single cell level can be effectively compared across patient samples. Methods Multiple clinical sites collected cryopreserved synovial tissue fragments from arthroplasty and synovial biopsy in a 10%-DMSO solution. Mechanical and enzymatic dissociation parameters were optimized for viable cell extraction and surface protein preservation for cell sorting and mass cytometry, as well as for reproducibility in RNA sequencing (RNA-seq). Cryopreserved synovial samples were collectively analyzed at a central processing site by a custom-designed and validated 35-marker mass cytometry panel. In parallel, each sample was flow sorted into fibroblast, T cell, B cell, and macrophage suspensions for bulk population RNA-seq and plate-based single cell CEL-Seq2 RNA-seq. Results Upon dissociation, cryopreserved synovial tissue fragments yielded a high frequency of viable cells, comparable to samples undergoing immediate processing. Optimization of synovial tissue dissociation across six clinical collection sites with ∼30 arthroplasty and ∼20 biopsy samples yielded a consensus digestion protocol using 100µg/mL of Liberase TL ™ enzyme. This protocol yielded immune and stromal cell lineages with preserved surface markers and minimized variability across replicate RNA-seq transcriptomes. Mass cytometry analysis of cells from cryopreserved synovium distinguished: 1) diverse fibroblast phenotypes, 2) distinct populations of memory B cells and antibody-secreting cells, and 3) multiple CD4+ and CD8+ T cell activation states. Bulk RNA sequencing of sorted cell populations demonstrated robust separation of synovial lymphocytes, fibroblasts, and macrophages. Single cell RNA-seq produced transcriptomes of over 1000 genes/cell, including transcripts encoding characteristic lineage markers identified. Conclusion We have established a robust protocol to acquire viable cells from cryopreserved synovial tissue with intact transcriptomes and cell surface phenotypes. A centralized pipeline to generate multiple high-dimensional analyses of synovial tissue samples collected across a collaborative network was developed. Integrated analysis of such datasets from large patient cohorts may help define molecular heterogeneity within RA pathology and identify new therapeutic targets and biomarkers.

Abstract Immune checkpoint inhibitor (ICI) therapies that promote T cell activation have improved outcomes for advanced malignancies yet also elicit harmful autoimmune reactions. The T cell mechanisms mediating these iatrogenic autoimmune events remain unclear. Here we assayed T cells from joints of patients affected by ICI-induced inflammatory arthritis (ICI-arthritis), which can present clinically indistinguishable from rheumatoid arthritis (RA). Compared to the autoimmune arthritides RA and psoriatic arthritis (PsA), ICI-arthritis joints contained an expanded CD38 hi CD127 − CD8 + T cell subset that displays cytotoxic, effector, and interferon (IFN) response signatures. The abundance of CD38 hi CD8 T cells in ICI-arthritis resulted from a limited number of clones that could be found proliferating in the joint. Exposure of synovial T cells to Type I IFN, more so than IFN-γ, induces the CD38 hi cytotoxic phenotype. Relative to other CD8 + T cell subsets in the joints, the CD38 hi population is distinct from a dysfunctional population and clonally most related to TCF7 + memory populations. Examination of synovial tissue from bilateral knee arthroplasty demonstrated considerable sharing of TCR clonotypes in the CD38 hi CD8 T cell fraction from both knees. These results define a distinct CD8 T cell subset that may be directly activated by ICI therapy and mediate a tissue-specific autoimmune cellular reaction in patient joints.

Abstract Inflammation of non-barrier immunologically quiescent tissues is associated with a massive influx of blood-borne innate and adaptive immune cells. Cues from the latter are likely to alter and expand the spectrum of states observed in cells that are constitutively resident. However, local communications between immigrant and resident cell types in human inflammatory disease remain poorly understood. Here, we explored heterogeneity of synovial fibroblasts (FLS) in inflamed joints of rheumatoid arthritis (RA) patients using paired single cell RNA and ATAC sequencing (scRNA/ATAC-seq), multiplexed imaging, and spatial transcriptomics along with in vitro modeling of cell extrinsic factor signaling. These analyses suggest that local exposures to myeloid and T cell derived cytokines, TNFα, IFNγ, IL-1β, or lack thereof, drive six distinct FLS states some of which closely resemble fibroblast states in other disease-affected tissues including skin and colon. Our results highlight a role for concurrent, spatially distributed cytokine signaling within the inflamed synovium.

Abstract Synovial tissue inflammation is a hallmark of rheumatoid arthritis (RA). Recent work has identified prominent pathogenic cell states in inflamed RA synovial tissue, such as T peripheral helper cells; however, the epigenetic regulation of these states has yet to be defined. Here, we examine genome-wide open chromatin at single-cell resolution in 30 synovial tissue samples, including 12 samples with transcriptional data in multimodal experiments. We identify 24 chromatin classes and predict their associated transcription factors, including a CD8 + GZMK + class associated with EOMES and a lining fibroblast class associated with AP-1. By integrating with an RA tissue transcriptional atlas, we propose that these chromatin classes represent ‘superstates’ corresponding to multiple transcriptional cell states. Finally, we demonstrate the utility of this RA tissue chromatin atlas through the associations between disease phenotypes and chromatin class abundance, as well as the nomination of classes mediating the effects of putatively causal RA genetic variants.

Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune disease involving antigen-specific T and B cells. Here, we perform single-cell RNA and repertoire sequencing on paired synovial tissue and blood samples from 12 seropositive RA patients. We identify clonally expanded CD4 + T cells, including CCL5+ cells and T peripheral helper (Tph) cells, which show a prominent transcriptomic signature of recent activation and effector function. CD8 + T cells show higher oligoclonality than CD4 + T cells, with the largest synovial clones enriched in GZMK+ cells. CD8 + T cells with possibly virus-reactive TCRs are distributed across transcriptomic clusters. In the B cell compartment, NR4A1+ activated B cells, and plasma cells are enriched in the synovium and demonstrate substantial clonal expansion. We identify synovial plasma cells that share BCRs with synovial ABC, memory, and activated B cells. Receptor-ligand analysis predicted IFNG and TNFRSF members as mediators of synovial Tph-B cell interactions. Together, these results reveal clonal relationships between functionally distinct lymphocyte populations that infiltrate the synovium of patients with RA.

ABSTRACT Ectopic lymphoid structures (ELS) can develop in rheumatoid arthritis (RA) synovial tissue, but the precise pathways of B cell activation and selection are not well understood. Here, we identified a unique B cell population in the synovium characterized by co-expression of a family of orphan nuclear receptors, NR4A1 (also known as NUR77), NR4A2 (NURR1) and NR4A3 (NOR1), that is highly enriched at both early and late stages of RA. NR4A B cells are rare in healthy peripheral blood, RA blood, and SLE kidney, but share markers with blood transcriptomic signatures that peak during RA disease flare. Using combined single cell transcriptomics and B cell receptor (BCR) sequencing, we demonstrate that NR4A synovial B cells have an activated transcriptomic profile that significantly overlaps with germinal center (GC) light zone (LZ) B cells and an accrual of somatic hypermutation that correlates with loss of naïve B cell status. NR4A B cells uniquely co-express lymphotoxin β and IL6, supporting important functions in ELS promotion and pro-inflammatory cytokine production. Further, the presence of shared clones in this activated B cell state and NR4A expressing synovial plasma cells (PC) and the rapid up-regulation with BCR stimulation points to in situ differentiation. Taken together, we identified a dynamic progression of B cell activation in RA synovial ELS, with NR4A transcription factors having an important role in antigen activation and local adaptive immune responses. One sentence summary B cells in the rheumatoid arthritis synovium undergo a spectrum of in situ activation, with the NR4A family of transcription factors having an important role in antigen stimulation, local adaptive immunity, and pathological B cell responses.

Perioperative practices have been introduced over the last decade to decrease the risk of periprosthetic joint infection (PJI). We sought to determine whether rates of revision total knee arthroplasty (TKA) for PJI decreased during the period 2006-2016.

In rheumatoid arthritis, inflammatory mediators extravasate from blood into joints via gaps between endothelial cells (ECs), but the contribution of ECs is not known. Sphingosine 1-phosphate receptor 1 (S1PR1), widely expressed on ECs, maintains the vascular barrier. Here, we assessed the contribution of vascular integrity and EC S1PR1 signaling to joint damage in mice exposed to serum-induced arthritis (SIA). EC-specific deletion of S1PR1 or pharmacological blockade of S1PR1 promoted vascular leak and amplified SIA, whereas overexpression of EC S1PR1 or treatment with an S1PR1 agonist delayed SIA. Blockade of EC S1PR1 induced membrane metalloproteinase-dependent cleavage of vascular endothelial cadherin (VE-cadherin), a principal adhesion molecule that maintains EC junctional integrity. We identified a disintegrin and a metalloproteinase domain 10 (ADAM10) as the principal VE-cadherin "sheddase." Mice expressing a stabilized VE-cadherin construct had decreased extravascular VE-cadherin and vascular leakage in response to S1PR1 blockade, and they were protected from SIA. Importantly, patients with active rheumatoid arthritis had decreased circulating S1P and microvascular expression of S1PR1, suggesting a dysregulated S1P/S1PR1 axis favoring vascular permeability and vulnerability. We present a model in which EC S1PR1 signaling maintains homeostatic vascular barrier function by limiting VE-cadherin shedding mediated by ADAM10 and suggest this signaling axis as a therapeutic target in inflammatory arthritis.