Abstract Super-enhancers (SEs) are a class of compound regulatory elements which control expression of key cell-identity genes. It remains unclear whether they are simply clusters of independent classical enhancers or whether SEs manifest emergent properties and should therefore be considered as a distinct class of element. Here, using synthetic biology and genome editing, we engineered the well characterised erythroid α-globin SE at the endogenous α-globin locus, removing all SE constituent elements in a mouse embryonic stem cell-line, to create a “blank canvas”. This has allowed us to re-build the SE through individual and combinatorial reinsertion of its five elements (R1, R2, R3, Rm, R4), to test the importance of each constituent’s sequence and position within the locus. Each re-inserted element independently creates a region of open chromatin and binds its normal repertoire of transcription factors; however, we found a high degree of functional interdependence between the five constituents. Surprisingly, the two strongest α-globin enhancers (R1 and R2) act sub-optimally both on their own and in combination, and although the other three elements (R3, Rm and R4) exhibit no discernible enhancer activity, they each exert a major positive effect in facilitating the activity of the classical enhancers (R1 and R2). This effect depends not simply on the sequence of each element but on their positions within the cluster. We propose that these “facilitators” are a novel form of regulatory element, important for ensuring the full activity of SEs, but distinct from conventional enhancer elements.

Abstract Mammalian genomes are subdivided into large (50-2000 kb) regions of chromatin referred to as Topologically Associating Domains (TADs or sub-TADs). Chromatin within an individual TAD contacts itself more frequently than with regions in surrounding TADs thereby directing enhancer-promoter interactions. In many cases, the borders of TADs are defined by convergently orientated boundary elements associated with CCCTC-binding factor (CTCF), which stabilises the cohesin complex on chromatin and prevents its translocation. This delimits chromatin loop extrusion which is thought to underlie the formation of TADs. However, not all CTCF-bound sites act as boundaries and, importantly, not all TADs are flanked by convergent CTCF sites. Here, we examined the CTCF binding sites within a ∼70 kb sub-TAD containing the duplicated mouse α-like globin genes and their five enhancers (5’-R1-R2-R3-Rm-R4-α1-α2-3’). The 5’ border of this sub-TAD is defined by a pair of CTCF sites. Surprisingly, we show that deletion of the CTCF binding sites within and downstream of the α-globin locus leaves the sub-TAD largely intact. The predominant 3’ border of the sub-TAD is defined by a steep reduction in contacts: this corresponds to the transcribed α2-globin gene rather than the CTCF sites at the 3’-end of the sub-TAD. Of interest, the almost identical α1- and α2-globin genes interact differently with the enhancers, resulting in preferential expression of the proximal α1-globin gene which behaves as a partial boundary between the enhancers and the distal α2-globin gene. Together, these observations provide direct evidence that actively transcribed genes can behave as boundary elements. Significance Statement Mammalian genomes are complex, organised 3D structures, partitioned into Topologically Associating Domains (TADs): chromatin regions that preferentially self-interact. These chromatin interactions are thought to be driven by a mechanism that continuously extrudes chromatin loops, forming structures delimited by chromatin boundary elements and reflecting the activity of enhancers and promoters. Boundary elements bind architectural proteins such as CCCTC-binding factor (CTCF). Previously, an overlap between the functional roles of enhancers and promoters has been shown. However, whether there is overlap between enhancers/promoters and boundary elements is not known. Here, we show that actively transcribed genes can also behave as boundary elements, similar to CTCF boundaries. In both cases, multi-protein complexes bound to these regions may stall the process of chromatin loop extrusion.

Abstract Mammalian gene expression patterns are controlled by regulatory elements, which interact within Topologically Associating Domains (TADs). The relationship between activation of regulatory elements, formation of structural chromatin interactions and gene expression during development is unclear. We developed Tiled-C, a low-input Chromosome Conformation Capture (3C) approach, to study chromatin architecture at high spatial and temporal resolution through in vivo mouse erythroid differentiation. Integrated analysis of matched chromatin accessibility and single-cell expression data shows that regulatory elements gradually become accessible within pre-existing TADs during early differentiation. This is followed by structural re-organization within the TAD and formation of specific contacts between enhancers and promoters. In contrast to previous reports, our high-resolution data show that these enhancer-promoter interactions are not established prior to gene expression, but formed gradually during differentiation, concomitant with progressive upregulation of gene activity. Together, these results provide new insight into the close, interdependent relationship between chromatin architecture and gene regulation during development.

ABSTRACT While the elements encoding enhancers and promoters have been relatively well studied, the full spectrum of insulator elements which bind the CCCTC binding factor (CTCF), is relatively poorly characterised. This is partly due to the genomic context of CTCF sites greatly influencing their roles and activity. Here we have developed an experimental system to determine the ability of consistently sized, individual CTCF elements to interpose between enhancers and promoters and thereby reduce gene expression during differentiation. Importantly, each element is tested in the identical location thereby minimising the effect of genomic context. We found no correlation between the ability of CTCF elements to block enhancer-promoter activity with the amount of CTCF or cohesin bound at the natural genomic sites of these elements; the degree of evolutionary conservation; or their resemblance to the consensus core sequences. Nevertheless, we have shown that the strongest enhancer-promoter blockers include a previously described bound element lying upstream of the CTCF core motif. In addition, we found other uncharacterised DNaseI footprints located close to the core motif that may affect function. We have developed an assay of CTCF sequences which will enable researchers to sub-classify CTCF elements in a uniform and unbiased way.

ABSTRACT Enhancers and their target promoters often come into close physical proximity when activated. This proximity may be explained by a variety of mechanisms; most recently via cohesin-mediated chromatin loop extrusion. Despite this compelling hypothesis, acute depletion of cohesin does not cause widespread changes in gene expression. We have tested the role of cohesin-mediated loop extrusion on gene expression at the mouse alpha-globin locus during erythropoiesis. Acute depletion of cohesin downregulates alpha-globin expression at early but not late stages of differentiation. When single or multiple CTCF sites are placed between the alpha-globin enhancers and promoters, alpha-gene expression is downregulated. Importantly, the orientation of the CTCF site plays a critical role, suggesting that within this activated domain, cohesin predominantly but not exclusively translocates from the enhancers to the promoters. We find that loop extrusion does play an important role in establishing enhancer-promoter proximity and consequent expression of inducible genes during differentiation.

We employ and extensively characterise an ex vivo culture system to study terminal erythroid maturation of CD34+ progenitors from the peripheral blood of normal individuals and patients with Congenital Dyserythropoietic Anaemia type 1 (CDA-I). Using morphological analysis, FACS analysis and the proteomic approach CyTOF, we analysed patient-derived erythroblasts stage- matched with those from healthy donors during the expansion phase and into early differentiation. In patient cells, aspects of disordered erythropoiesis manifest midway through differentiation, including increased proliferation and changes in the DNA accessibility profile. We also show that cultured erythroblasts from CDA-I patients recapitulate the pathognomic feature of this erythroid disorder with up to 40% of the cells having abnormal spongy chromatin morphology by electron microscopy, as well as upregulation of GDF15, a marker of ineffective erythropoiesis. In the tertiary phase of culture, patient cells show significantly less enucleation and there is persistence of earlier erythroid precursors. Furthermore, the enucleation defect appears to be more severe in patients with mutations in C15orf41, as compared to the other known causative gene CDAN1, indicating a genotype/phenotype correlation in CDA-I. Such erythroblasts are a valuable resource for investigating the pathogenesis of this disease and provide the opportunity for streamlining diagnosis for CDA-I patients and ultimately other forms of unexplained anaemia.

Abstract Mouse embryonic stem cells (mESCs) can be manipulated in vitro to recapitulate the process of erythropoiesis, during which multipotent cells undergo lineage specification, differentiation and maturation to produce erythroid cells. Although useful for identifying specific progenitors and precursors, this system has not been fully exploited as a source of cells to analyse erythropoiesis. Here, we establish a protocol in which characterised erythroblasts can be isolated in a scalable manner from differentiated embryoid bodies (EBs). Using transcriptional and epigenetic analysis, we demonstrate that this system faithfully recapitulates normal primitive erythropoiesis and fully reproduces the effects of natural and engineered mutations seen in primary cells obtained from mouse models. We anticipate this system to be of great value in reducing the time and costs of generating and maintaining mouse lines in a number of research scenarios. Key Points Scalable purification of primitive-like erythroid cells from in vitro differentiated mESCs offers tractable tools for genetic studies In vitro derived erythroid cells recapitulate wild type and engineered mutation phenotypes observed in primary cells obtained from mouse models

Knowledge of locations and activities of cis-regulatory elements (CREs) is needed to decipher basic mechanisms of gene regulation and to understand the impact of genetic variants on complex traits. Previous studies identified candidate CREs (cCREs) using epigenetic features in one species, making comparisons difficult across species. In contrast, we conducted a cross-species study defining epigenetic states and identifying cCREs in blood cell types to generate regulatory maps that are comparable across species. This study used integrative modeling of eight epigenetic features jointly in human and mouse in our Validated Systematic Integration (VISION) Project. The contribution of each epigenetic state in cCREs to gene regulation was estimated from a multivariate regression against gene expression across cell types. We used these values to estimate epigenetic state Regulatory Potential (esRP) scores for each cCRE in each cell type, which are useful for visualizing and categorizing dynamic changes in cCREs. Groups of cCREs displaying similar patterns of regulatory activity in human and mouse cell types, obtained by joint clustering on esRP scores, harbored distinctive transcription factor binding motifs that were similar across species. Genetic variants associated with blood cell phenotypes were highly and specifically enriched in the catalog of human VISION cCREs, supporting its utility for understanding impacts of noncoding genetic variants on blood cell-related traits. A cross-species comparison of cCREs, based on the joint modeling, revealed both conserved and lineage-specific patterns of epigenetic evolution, even in the absence of genomic sequence alignment. We provide these resources through tools and browsers at http://usevision.org.

Abstract As the structure of the genome is analysed at ever increasing resolution it is becoming clear that there is considerable variation in the 3D chromatin architecture across different cell types. It has been proposed that this may, in part, be due to increased recruitment of cohesin to activated cis-elements (enhancers and promoters) leading to cell-type specific loop extrusion underlying the formation of new subTADs. Here we show that cohesin correlates well with the presence of active enhancers and this varies in an allele-specific manner with the presence or absence of polymorphic enhancers which vary from one individual to another. Using the alpha globin cluster as a model, we show that when all enhancers are removed, peaks of cohesin disappear from these regions and the erythroid specific subTAD is no longer formed. Re-insertion of the major alpha globin enhancer (R2) is associated with the appearance of a new peak of cohesin at the site of insertion. In complementary experiments insertion of R2 into a “neutral” region of the genome recruits cohesin, induces transcription and creates a new large (75kb) erythroid specific domain. Together these findings support the proposal that active enhancers recruit cohesin, stimulate loop extrusion and promote the formation of cell specific subTADs.

Genome-wide association studies (GWAS) have identified over 150,000 links between common genetic variants and human traits or complex diseases. Over 80% of these associations map to polymorphisms in non-coding DNA. Therefore, the challenge is to identify disease-causing variants, the genes they affect, and the cells in which these effects occur. We have developed a platform using ATAC-seq, DNaseI footprints, NG Capture-C and machine learning to address this challenge. Applying this approach to red blood cell traits identifies a significant proportion of known causative variants and their effector genes, which we show can be validated by direct in vivo modelling.