A retrovirus packaging cell line was constructed by using portions of the Moloney murine leukemia virus in which the gag, pol, and env genes of the helper virus were separated onto two different plasmids and in which the psi packaging signal and 3' long terminal repeat were removed. The plasmid containing the gag and pol genes and the plasmid containing the env gene were cotransfected into NIH 3T3 cells. Clones that produced high levels of reverse transcriptase and env protein were tested for their ability to package the replication-defective retrovirus vectors delta neo and N2. One of the gag-pol and env clones (GP+E-86) was able to transfer G418 resistance to recipient cells at a titer of as high as 1.7 X 10(5) when it was used to package delta neo and as high as 4 X 10(6) when it was used to package N2. Supernatants of clones transfected with the intact parent gag-pol-env plasmid 3P0 had comparable titers (as high as 6.5 X 10(4) with delta neo; as high as 1.7 X 10(5) with N2). Tests for recombination events that might result in intact retrovirus showed no evidence for the generation of replication-competent virus. These results suggest that gag, pol, and env, when present on different plasmids, may provide an efficient and safe packaging line for use in retroviral gene transfer.

Research Article1 October 1996free access Purification and biochemical heterogeneity of the mammalian SWI-SNF complex. W. Wang W. Wang Howard Hughes Medical Institute, Department of Developmental Biology, Stanford University, CA 94305-5428, USA. Search for more papers by this author J. Côté J. Côté Howard Hughes Medical Institute, Department of Developmental Biology, Stanford University, CA 94305-5428, USA. Search for more papers by this author Y. Xue Y. Xue Howard Hughes Medical Institute, Department of Developmental Biology, Stanford University, CA 94305-5428, USA. Search for more papers by this author S. Zhou S. Zhou Howard Hughes Medical Institute, Department of Developmental Biology, Stanford University, CA 94305-5428, USA. Search for more papers by this author P. A. Khavari P. A. Khavari Howard Hughes Medical Institute, Department of Developmental Biology, Stanford University, CA 94305-5428, USA. Search for more papers by this author S. R. Biggar S. R. Biggar Howard Hughes Medical Institute, Department of Developmental Biology, Stanford University, CA 94305-5428, USA. Search for more papers by this author C. Muchardt C. Muchardt Howard Hughes Medical Institute, Department of Developmental Biology, Stanford University, CA 94305-5428, USA. Search for more papers by this author G. V. Kalpana G. V. Kalpana Howard Hughes Medical Institute, Department of Developmental Biology, Stanford University, CA 94305-5428, USA. Search for more papers by this author S. P. Goff S. P. Goff Howard Hughes Medical Institute, Department of Developmental Biology, Stanford University, CA 94305-5428, USA. Search for more papers by this author M. Yaniv M. Yaniv Howard Hughes Medical Institute, Department of Developmental Biology, Stanford University, CA 94305-5428, USA. Search for more papers by this author J. L. Workman J. L. Workman Howard Hughes Medical Institute, Department of Developmental Biology, Stanford University, CA 94305-5428, USA. Search for more papers by this author G. R. Crabtree G. R. Crabtree Howard Hughes Medical Institute, Department of Developmental Biology, Stanford University, CA 94305-5428, USA. Search for more papers by this author W. Wang W. Wang Howard Hughes Medical Institute, Department of Developmental Biology, Stanford University, CA 94305-5428, USA. Search for more papers by this author J. Côté J. Côté Howard Hughes Medical Institute, Department of Developmental Biology, Stanford University, CA 94305-5428, USA. Search for more papers by this author Y. Xue Y. Xue Howard Hughes Medical Institute, Department of Developmental Biology, Stanford University, CA 94305-5428, USA. Search for more papers by this author S. Zhou S. Zhou Howard Hughes Medical Institute, Department of Developmental Biology, Stanford University, CA 94305-5428, USA. Search for more papers by this author P. A. Khavari P. A. Khavari Howard Hughes Medical Institute, Department of Developmental Biology, Stanford University, CA 94305-5428, USA. Search for more papers by this author S. R. Biggar S. R. Biggar Howard Hughes Medical Institute, Department of Developmental Biology, Stanford University, CA 94305-5428, USA. Search for more papers by this author C. Muchardt C. Muchardt Howard Hughes Medical Institute, Department of Developmental Biology, Stanford University, CA 94305-5428, USA. Search for more papers by this author G. V. Kalpana G. V. Kalpana Howard Hughes Medical Institute, Department of Developmental Biology, Stanford University, CA 94305-5428, USA. Search for more papers by this author S. P. Goff S. P. Goff Howard Hughes Medical Institute, Department of Developmental Biology, Stanford University, CA 94305-5428, USA. Search for more papers by this author M. Yaniv M. Yaniv Howard Hughes Medical Institute, Department of Developmental Biology, Stanford University, CA 94305-5428, USA. Search for more papers by this author J. L. Workman J. L. Workman Howard Hughes Medical Institute, Department of Developmental Biology, Stanford University, CA 94305-5428, USA. Search for more papers by this author G. R. Crabtree G. R. Crabtree Howard Hughes Medical Institute, Department of Developmental Biology, Stanford University, CA 94305-5428, USA. Search for more papers by this author Author Information W. Wang1, J. Côté1, Y. Xue1, S. Zhou1, P. A. Khavari1, S. R. Biggar1, C. Muchardt1, G. V. Kalpana1, S. P. Goff1, M. Yaniv1, J. L. Workman1 and G. R. Crabtree1 1Howard Hughes Medical Institute, Department of Developmental Biology, Stanford University, CA 94305-5428, USA. The EMBO Journal (1996)15:5370-5382https://doi.org/10.1002/j.1460-2075.1996.tb00921.x PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info We have purified distinct complexes of nine to 12 proteins [referred to as BRG1-associated factors (BAFs)] from several mammalian cell lines using an antibody to the SWI2-SNF2 homolog BRG1. Microsequencing revealed that the 47 kDa BAF is identical to INI1. Previously INI1 has been shown to interact with and activate human immunodeficiency virus integrase and to be homologous to the yeast SNF5 gene. A group of BAF47-associated proteins were affinity purified with antibodies against INI1/BAF47 and were found to be identical to those co-purified with BRG1, strongly indicating that this group of proteins associates tightly and is likely to be the mammalian equivalent of the yeast SWI-SNF complex. Complexes containing BRG1 can disrupt nucleosomes and facilitate the binding of GAL4-VP16 to a nucleosomal template similar to the yeast SWI-SNF complex. Purification of the complex from several cell lines demonstrates that it is heterogeneous with respect to subunit composition. The two SWI-SNF2 homologs, BRG1 and hbrm, were found in separate complexes. Certain cell lines completely lack BRG1 and hbrm, indicating that they are not essential for cell viability and that the mammalian SWI-SNF complex may be tailored to the needs of a differentiated cell type. Previous ArticleNext Article Volume 15Issue 191 October 1996In this issue RelatedDetailsLoading ...

Retroviral Gag protein is capable of directing the assembly of virion particles independent of other retroviral elements and plays an important role early in the infection of a cell. Using the GAL4 two hybrid system, we screened a cDNA expression library and identified two host proteins, cyclophillins (CyPs) A and B, which interact specifically with the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag polyprotein Pr55gag. Glutathione S-transferase-CyP fusion proteins bind tightly to Pr55gag in vitro, as well as to the HIV-1 capsid protein p24. Cyclosporin A efficiently disrupts the Gag-CyPA interaction and less efficiently disrupts the Gag-CyPB interaction. The Gag-CyP interaction may be important for the HIV-1 life cycle and may be relevant to the pathology caused by this immunosuppressive virus.

The retinoblastoma tumor suppressor protein (RB) binds several cellular proteins involved in cell cycle progression. Using the yeast two-hybrid system, we found that RB bound specifically to the protein BRG1. BRG1 shares extensive sequence similarity to Drosophila brahma, an activator of homeotic gene expression, and the yeast transcriptional activator SNF2/SWI2. BRG1 contains an RB-binding motif found in viral oncoproteins and bound to the A/B pocket and the hypophosphorylated form of RB. BRG1 did not bind RB in viral oncoprotein-transformed cells. Coimmunoprecipitation experiments suggested BRG1 associates with the RB family in vivo. In the human carcinoma cell line SW13, BRG1 exhibited tumor suppressor activity by inducing formation of flat, growth-arrested cells. This activity depended on the ability of BRG1 to cooperate and complex with RB, as both an RB-nonbinding mutant of BRG1 and the sequestration of RB by adenovirus E1A protein abolished flat cell formation.

A model of reverse transcription has been devised by which the detailed architecture of ten molecular structures is predicted. The model includes a number of novel features for which experimental evidence is presented. First, growing minus DNA strand is copied from the viral RNA only up to a position about 150 nucleotides from the 5′ end of the RNA. Second, plus-strand DNA, after being copied from approximately 600 nucleotides at the 5′ end of the minus-strand DNA, then transcribes the first approximately 20 nucleotides of the tRNApro primer (which is covalently attached to the 5′ end of the minus DNA strand). The 3′ ends of the minus and plus DNA probably form a hybrid through the homology conferred by the primer binding site sequences. Third, the minus and plus DNA strands are elongated in a continuous fashion resulting in a linear double-stranded DNA molecule containing a 600 nucleotide direct repeat at both ends. Thus most of the features of the model have experimental support, and it appears to provide a credible description of reverse transcription.

The flk2 receptor tyrosine kinase has been implicated in hematopoietic development. Mice deficient in flk2 were generated. Mutants developed into healthy adults with normal mature hematopoietic populations. However, they possessed specific deficiencies in primitive B lymphoid progenitors. Bone marrow transplantation experiments revealed a further deficiency in T cell and myeloid reconstitution by mutant stem cells. Mice deficient for both c-kit and flk2 exhibited a more severe phenotype characterized by large overall decreases in hematopoietic cell numbers, further reductions in the relative frequencies of lymphoid progenitors, and a postnatal lethality. Taken together, the data suggest that flk2 plays a role both in multipotent stem cells and in lymphoid differentiation.

Upon entry into a host cell, retroviruses direct the reverse transcription of the viral RNA genome and the establishment of an integrated proviral DNA. The retroviral integrase protein (IN) is responsible for the insertion of the viral DNA into host chromosomal targets. The two-hybrid system was used to identify a human gene product that binds tightly to the human immunodeficiency virus-type 1 (HIV-1) integrase in vitro and stimulates its DNA-joining activity. The sequence of the gene suggests that the protein is a human homolog of yeast SNF5, a transcriptional activator required for high-level expression of many genes. The gene, termed INI1 (for integrase interactor 1), may encode a nuclear factor that promotes integration and targets incoming viral DNA to active genes.

The product of the Ion gene in Escherichia coli, protease La, plays an important role in the degradation of abnormal proteins. To determine whether the presence of abnormal proteins stimulates expression of this gene, we examined its transcription using a Ion-IacZ operon fusion. After the cells synthesized large amounts of aberrant polypeptides (e.g. following incorporation of the arginine analog, canavanine, or production of incomplete proteins with puromycin, or induction of translational errors with streptomycin), these cells showed a two to three fold increase in Ion-IacZ expression. Furthermore, synthesis of a single cloned protein, e.g. human tissue plasminogin activator, caused a similar increase in Ion transcription. This induction of Ion by abnormal proteins requires the heat shock regulatory gene htpR and was not seen in htpR− cells. Under these various conditions, other heat shock proteins were also induced. Thus, the appearance of aberrant cell proteins may be a common signal under many adverse conditions for the induction of cell protease (or proteases) and other heat shock proteins.

Cells have evolved multiple mechanisms to inhibit viral replication. To identify previously unknown antiviral activities, we screened mammalian complementary DNA (cDNA) libraries for genes that prevent infection by a genetically marked retrovirus. Virus-resistant cells were selected from pools of transduced clones, and an active antiviral cDNA was recovered. The gene encodes a CCCH-type zinc finger protein designated ZAP. Expression of the gene caused a profound and specific loss of viral messenger RNAs (mRNAs) from the cytoplasm without affecting the levels of nuclear mRNAs. The finding suggests the existence of a previously unknown machinery for the inhibition of virus replication, targeting a step in viral gene expression.