Abstract We present a new approach for macromolecular structure determination from multiple particles in electron cryo-tomography (cryo-ET) data sets. Whereas existing subtomogram averaging approaches are based on 3D data models, we propose to optimise a regularised likelihood target that approximates a function of the 2D experimental images. In addition, analogous to Bayesian polishing and contrast transfer function (CTF) refinement in single-particle analysis, we describe approaches that exploit the increased signal-to-noise ratio in the averaged structure to optimise tilt series alignments, beam-induced motions of the particles throughout the tilt series acquisition, defoci of the individual particles, as well as higher-order optical aberrations of the microscope. Implementation of our approaches in the open-source software package RELION aims to facilitate their general use, in particular for those researchers who are already familiar with its single-particle analysis tools. We illustrate for three applications that our approaches allow structure determination from cryo-ET data to resolutions sufficient for de novo atomic modelling.

Abstract Nitrosopumilus maritimus is an ammonia-oxidizing archaeon that is crucial to the global nitrogen cycle 1,2 . A critical step for nitrogen oxidation is the entrapment of ammonium ions from a dilute marine environment at the cell surface and their subsequent channelling to the cell membrane of N. maritimus . Here we elucidate the structure of the molecular machinery responsible for this process, comprising the surface layer (S-layer), using electron cryotomography and subtomogram averaging from cells. We supplemented our in situ structure of the ammonium-binding S-layer array with a single-particle electron cryomicroscopy structure, revealing detailed features of this immunoglobulin-rich and glycan-decorated S-layer. Biochemical analyses showed strong ammonium binding by the cell surface, which was lost after S-layer disassembly. Sensitive bioinformatic analyses identified similar S-layers in many ammonia-oxidizing archaea, with conserved sequence and structural characteristics. Moreover, molecular simulations and structure determination of ammonium-enriched specimens enabled us to examine the cation-binding properties of the S-layer, revealing how it concentrates ammonium ions on its cell-facing side, effectively acting as a multichannel sieve on the cell membrane. This in situ structural study illuminates the biogeochemically essential process of ammonium binding and channelling, common to many marine microorganisms that are fundamental to the nitrogen cycle.

Electron tomography of frozen, hydrated samples allows structure determination of macromolecular complexes that are embedded in complex environments. Provided that the target complexes may be localised in noisy, three‐dimensional tomographic reconstructions, averaging images of multiple instances of these molecules can lead to structures with sufficient resolution for de novo atomic modelling. Although many research groups have contributed image processing tools for these tasks, a lack of standardisation and interoperability represents a barrier for newcomers to the field. Here, we present an image processing pipeline for electron tomography data in RELION‐5, with functionality ranging from the import of unprocessed movies to the automated building of atomic models in the final maps. Our explicit definition of metadata items that describe the steps of our pipeline has been designed for interoperability with other software tools and provides a framework for further standardisation.

Abstract Deinococcus radiodurans is a deep-branching extremophilic bacterium that is remarkably tolerant to numerous environmental stresses, including large doses of ultraviolet radiation and extreme temperatures. It can even survive in outer space for several years. This endurance of D. radiodurans has been partly ascribed to its atypical cell envelope comprising an inner membrane, a large periplasmic space with a thick peptidoglycan (PG) layer, and an outer membrane (OM) covered by a surface layer (S-layer). Despite intense research, molecular principles governing envelope organization and OM stabilization are unclear in D. radiodurans and related bacteria. Here, we report an electron cryomicroscopy (cryo-EM) structure of the abundant D. radiodurans OM protein SlpA, showing how its C-terminal segment forms homotrimers of 30-stranded β-barrels in the OM, whereas its N-terminal segment forms long, homotrimeric coiled coils linking the OM to the PG layer via S-layer homology (SLH) domains. Using the power of structure prediction and sequence-based bioinformatics, we further show that SlpA-like proteins are widespread in deep-branching Gram-negative bacteria, plausibly constituting an ancestral superfamily of OM-PG connectors, important for organizing the cell envelopes of many bacteria. Finally, combining our atomic structures with tomography of cell envelopes, we report a model for the cell surface of D. radiodurans , with implications on understanding the cell surface organization and hyperstability of D. radiodurans and related bacteria. Furthermore, the widespread occurrence of SlpA-like OM-PG connectors in deep-branching bacteria will help in understanding the evolutionary transition between Gram-negative and Gram-positive bacteria.

Abstract Deinococcus radiodurans is an atypical diderm bacterium with a remarkable ability to tolerate various environmental stresses, partly because of its complex cell envelope encapsulated within a hyperstable surface layer (S-layer). Despite decades of research into this cell envelope, atomic structural details of the S-layer have remained obscure. In this study, we report the electron cryomicroscopy structure of the D. radiodurans S-layer, showing how it is formed by the Hexagonally Packed Intermediate-layer (HPI) protein arranged in a planar hexagonal lattice. The HPI protein forms an array of immunoglobulin-like folds within the S-layer, with each monomer extending into the adjoining hexamer, leading to a highly interconnected, stable, sheet-like arrangement. Using electron cryotomography and subtomogram averaging from focused ion beam-milled D. radiodurans cells, we obtained a structure of the cellular S-layer, showing how this HPI S-layer coats native membranes on the surface of cells. Our S-layer structure from the diderm bacterium D. radiodurans shows similarities to immunoglobulin-like domain-containing S-layers from monoderm bacteria and archaea, highlighting shared traits in cell surface organization across different domains of life, with connotations on the evolution of immunoglobulin-based molecular recognition systems in eukaryotes.

Abstract DPANN archaea are a diverse group of microorganisms characterised by small cells and reduced genomes. To date, all cultivated DPANN archaea are ectosymbionts that require direct cell contact with an archaeal host species for growth and survival. However, these interactions and their impact on the host species are poorly understood. Here, we show that a DPANN archaeon ( Candidatus Nanohaloarchaeum antarcticus) engages in parasitic interactions with its host ( Halorubrum lacusprofundi ) that result in host cell lysis. During these interactions, the nanohaloarchaeon appears to enter, or be engulfed by, the host cell. Our results provide experimental evidence for a predatory-like lifestyle of an archaeon, suggesting that at least some DPANN archaea may have roles in controlling host populations and their ecology.

Abstract Chaperone-Usher Pathway (CUP) pili are major adhesins in Gram-negative bacteria, mediating bacterial adherence to biotic and abiotic surfaces. While classical CUP pili have been extensively characterized, little is known about so-called archaic CUP pili, which are phylogenetically widespread and promote biofilm formation by several human pathogens. In this study, we present the electron cryomicroscopy structure of the archaic CupE pilus from the opportunistic human pathogen Pseudomonas aeruginosa . We show that CupE pili consist of CupE1 subunits arranged in a zigzag architecture, with an N-terminal donor β-strand extending from each subunit into the next, where it is anchored by hydrophobic interactions, resulting in an overall flexible pilus arrangement. Imaging CupE pili on the surface of P. aeruginosa cells using electron cryotomography shows that CupE pili adopt variable curvatures in response to their environment, which may facilitate their role in promoting cohesion between bacterial cells. Finally, bioinformatic analysis shows the widespread abundance of cupE genes in isolates of P. aeruginosa and the co-occurrence of cupE with other cup clusters, suggesting interdependence of cup pili in regulating bacterial adherence within biofilms. Taken together, our study provides insights into the architecture of archaic CUP pili and their role in promoting cellular adhesion and biofilm formation in P. aeruginosa .

ABSTRACT Surface layers (S-layers) are proteinaceous, two-dimensional crystals that constitute the outermost components of many prokaryotic cell envelopes. In this study, we investigated principles of S-layer biogenesis on the outer membrane in the bacterial model organism Caulobacter crescentus . Fluorescent microscopy revealed localised incorporation of new S-layer at the poles and mid-cell, consistent with elongation and division phases of the cell cycle. Next, light microscopy and electron cryotomography investigations of drug-treated bacteria revealed that bacterial actin homologue MreB is crucial for localised S-layer insertion. We further uncovered that S-layer biogenesis follows new peptidoglycan synthesis and localises to regions of high cell wall turnover. Finally, correlated cryo-light microscopy and electron cryotomographic analysis of regions of S-layer insertion showed the presence of gaps in the hexagonal S-layer lattice, contrasting with other S-layers completed by defined symmetric defects. Our findings provide insight into how C. crescentus cells form an ordered S-layer on their surface, providing evidence for coordination between the biogenesis of the cell envelope at multiple levels.

Abstract DPANN Archaea are a diverse group of organisms typically characterised by small cells and reduced genomes. To date, all cultivated DPANN Archaea are ectosymbionts that require direct cell contact with an archaeal host species for proliferation. However, the dynamics of DPANN – host interactions and the impacts of these interactions on the host species are poorly understood. Here, we show that one DPANN archaeon ( Candidatus Nanohaloarchaeum antarcticus) engages in parasitic interactions with its host ( Halorubrum lacusprofundi ) that result in host cell lysis. Our data also suggest that these interactions involve invasion of the host cell by the nanohaloarchaeon. This is the first reported instance of such a predatory-like lifestyle amongst Archaea and indicates that some DPANN Archaea may interact with host populations in a manner similar to viruses.