Dopamine (DA) plays a critical role in the brain, and the ability to directly measure dopaminergic activity is essential for understanding its physiological functions. We therefore developed red fluorescent G-protein-coupled receptor-activation-based DA (GRABDA) sensors and optimized versions of green fluorescent GRABDA sensors. In response to extracellular DA, both the red and green GRABDA sensors exhibit a large increase in fluorescence, with subcellular resolution, subsecond kinetics and nanomolar-to-submicromolar affinity. Moreover, the GRABDA sensors resolve evoked DA release in mouse brain slices, detect evoked compartmental DA release from a single neuron in live flies and report optogenetically elicited nigrostriatal DA release as well as mesoaccumbens dopaminergic activity during sexual behavior in freely behaving mice. Coexpressing red GRABDA with either green GRABDA or the calcium indicator GCaMP6s allows tracking of dopaminergic signaling and neuronal activity in distinct circuits in vivo.

SUMMARY Neuropeptides are key signaling molecules in the endocrine and nervous systems that regulate many critical physiological processes, including energy balance, sleep and circadian rhythms, stress, and social behaviors. Understanding the functions of neuropeptides in vivo requires the ability to monitor their dynamics with high specificity, sensitivity, and spatiotemporal resolution; however, this has been hindered by the lack of direct, sensitive and non-invasive tools. Here, we developed a series of GRAB ( G protein-coupled r eceptor a ctivation‒ b ased) sensors for detecting somatostatin (SST), cholecystokinin (CCK), corticotropin-releasing factor (CRF), neuropeptide Y (NPY), neurotensin (NTS), and vasoactive intestinal peptide (VIP). These fluorescent sensors utilize the corresponding GPCRs as the neuropeptide-sensing module with the insertion of a circular-permutated GFP as the optical reporter. This design detects the binding of specific neuropeptides at nanomolar concentration with a robust increase in fluorescence. We used these GRAB neuropeptide sensors to measure the spatiotemporal dynamics of endogenous SST release in isolated pancreatic islets and to detect the release of both CCK and CRF in acute brain slices. Moreover, we detect endogenous CRF release induced by stressful experiences in vivo using fiber photometry and 2-photon imaging in mice. Together, these new sensors establish a robust toolkit for studying the release, function, and regulation of neuropeptides under both physiological and pathophysiological conditions.

Abstract As a peptide hormone and neuromodulator, oxytocin (OT) plays a critical role in a variety of physiological and pathophysiological processes in both the central nervous system and the periphery. However, the processes that regulate spatial OT release in the brain remain enigmatic. Here, we developed a genetically encoded GPCR activation-based (GRAB) OT sensor called GRAB OT1.0 . Using this sensor, we directly visualized stimulation-induced OT release from specific compartments of OT neurons in acute brain slices, and discovered that N-type calcium channels predominantly mediate axonal OT release, while L-type calcium channels mediate somatodendritic OT release. In addition, we found that components in the fusion machinery of OT release differ between axon terminals versus somata and dendrites. Finally, we demonstrated the sensor responses to the activation of OT neurons in various brain regions in vivo and revealed region specific OT release during male courtship behavior. Taken together, these results provide key insights regarding the role of compartmental OT release in the control of physiological and behavioral functions.

The ability to directly measure acetylcholine (ACh) release is an essential first step towards understanding its physiological function. Here we optimized the GRAB ACh ( G PC R - A ctivation– B ased- ACh ) sensor with significantly improved sensitivity and minimal downstream coupling. Using this sensor, we measured in-vivo cholinergic activity in both Drosophila and mice, revealing compartmental ACh signals in fly olfactory center and single-trial ACh dynamics in multiple regions of the mice brain under a variety of different behaviors

Intercellular communication mediated by a large number of neuromodulators diversifies physiological actions, yet neuromodulation remains poorly understood despite the recent upsurge of genetically encoded transmitter sensors. Here, we report the development of a versatile genetically encoded sensor-based image analysis program (GESIAP) that utilizes MATLAB-based algorithms to achieve high-throughput, high-resolution processing of sensor-based functional imaging data. GESIAP enables delineation of fundamental properties (e.g., transmitter spatial diffusion extent, quantal size, quantal content, release probability, pool size, and refilling rate at single release sites) of transmission mediated by various transmitters (i.e., monoamines, acetylcholine, neuropeptides, and glutamate) at various cell types (i.e., neurons, astrocytes, and other non-neuronal cells) of various animal species (i.e., mouse, rat, and human). Our analysis appraises a dozen of newly developed transmitter sensors, validates a conserved model of restricted non-volume neuromodulatory synaptic transmission, and accentuates a broad spectrum of presynaptic release properties that variegate neuromodulation.

Dopamine (DA) plays multiple roles in a wide range of physiological and pathological processes via a vast network of dopaminergic projections. To fully dissect the spatiotemporal dynamics of DA release in both dense and sparsely innervated brain regions, we developed a series of green and red fluorescent GPCR activation-based DA (GRABDA) sensors using a variety of DA receptor subtypes. These sensors have high sensitivity, selectivity, and signal-to-noise properties with subsecond response kinetics and the ability to detect a wide range of DA concentrations. We then used these sensors in freely moving mice to measure both optogenetically evoked and behaviorally relevant DA release while measuring neurochemical signaling in the nucleus accumbens, amygdala, and cortex. Using these sensors, we also detected spatially resolved heterogeneous cortical DA release in mice performing various behaviors. These next-generation GRABDA sensors provide a robust set of tools for imaging dopaminergic activity under a variety of physiological and pathological conditions.

The monoamine neuromodulator dopamine (DA) plays a critical role in the brain, and the ability to directly measure dopaminergic activity is essential for understanding its physiological functions. We therefore developed the first red fluorescent GPCR-activation–based DA (GRABDA) sensors and optimized versions of green fluorescent GRABDA sensors following our previous studies. In response to extracellular DA, both the red and green GRABDA sensors have a large increase in fluorescence (ΔF/F values of 150% and 340%, respectively), with subcellular resolution, subsecond kinetics, and nanomolar to submicromolar affinity. Moreover, both the red and green GRABDA sensors readily resolve evoked DA release in mouse brain slices, detect compartmental DA release in live flies with single-cell resolution, and report optogenetically elicited nigrostriatal DA release as well as mesoaccumbens dopaminergic activity during sexual behavior in freely behaving mice. Importantly, co-expressing red GRABDA with either green GRABDA or the calcium indicator GCaMP6s provides a robust tool for simultaneously tracking neuronal activity and dopaminergic signaling in distinct circuits in vivo .

Serotonin (5-HT) is a phylogenetically conserved monoamine neurotransmitter modulating a variety of processes in the brain. To directly visualize the dynamics of 5-HT, we developed a genetically encoded GPCR-Activation-Based 5-HT (GRAB5-HT) sensor with high sensitivity, selectivity, and spatiotemporal resolution. GRAB5-HT, detected 5-HT release in multiple physiological and pathological conditions in both flies and mice, and thus provides new insights into the dynamics and mechanisms of 5-HT signaling.