SUMMARY Neuropeptides are key signaling molecules in the endocrine and nervous systems that regulate many critical physiological processes, including energy balance, sleep and circadian rhythms, stress, and social behaviors. Understanding the functions of neuropeptides in vivo requires the ability to monitor their dynamics with high specificity, sensitivity, and spatiotemporal resolution; however, this has been hindered by the lack of direct, sensitive and non-invasive tools. Here, we developed a series of GRAB ( G protein-coupled r eceptor a ctivation‒ b ased) sensors for detecting somatostatin (SST), cholecystokinin (CCK), corticotropin-releasing factor (CRF), neuropeptide Y (NPY), neurotensin (NTS), and vasoactive intestinal peptide (VIP). These fluorescent sensors utilize the corresponding GPCRs as the neuropeptide-sensing module with the insertion of a circular-permutated GFP as the optical reporter. This design detects the binding of specific neuropeptides at nanomolar concentration with a robust increase in fluorescence. We used these GRAB neuropeptide sensors to measure the spatiotemporal dynamics of endogenous SST release in isolated pancreatic islets and to detect the release of both CCK and CRF in acute brain slices. Moreover, we detect endogenous CRF release induced by stressful experiences in vivo using fiber photometry and 2-photon imaging in mice. Together, these new sensors establish a robust toolkit for studying the release, function, and regulation of neuropeptides under both physiological and pathophysiological conditions.

Abstract The serotonergic system plays important roles in both physiological and pathological processes, and is a widely used therapeutic target for many psychiatric disorders. Although several genetically encoded GFP-based serotonin (5-HT) sensors were recently developed, their sensitivities and spectral profiles are relatively limited. To overcome these limitations, we optimized green fluorescent G-protein-coupled receptor (GPCR)-activation-based 5-HT (GRAB 5-HT ) sensors and developed a new red fluorescent GRAB 5-HT sensor. These sensors have excellent cell surface trafficking, high specificity, sensitivity, and spatiotemporal resolution, making them suitable for monitoring 5-HT dynamics in vivo . Besides recording subcortical 5-HT release in freely moving mice, we observed both uniform and gradient 5-HT release in the mouse dorsal cortex with mesoscopic imaging. Finally, we performed dual-color imaging and observed seizure-induced waves of 5-HT release throughout the cortex following calcium and endocannabinoid waves. In summary, these 5-HT sensors can offer valuable insights regarding the serotonergic system in both physiological and pathological states.

Despite the vital role of neuromodulation in the neural system, the specific spatiotemporal dynamics of neuromodulators and their interactions with neuronal activities in vivo are still unclear, hampering our understanding of their information representation and functional contributions systemically. To address this problem, we employed two-photon synthetic aperture microscopy (2pSAM) to record long-term neuronal and neuromodulatory olfactory responses across the Drosophila brain at high speed. Our results revealed distinct response properties, global information propagation, functional connectivity, and odor identity representation among neuronal, cholinergic, and serotoninergic dynamics across multiple brain regions. We discovered the compensation between neuronal activity and cholinergic dynamics, both in the odor identity representation across the brain and the functional connectivity network structures of specific brain regions. Moreover, employing low-dimensional manifold and functional connectivity network analyses, we characterized the stable representation of cholinergic dynamics over a long term. Collectively, our unbiased and comprehensive investigation unveiled the prominent involvement of acetylcholine (ACh) in shaping olfactory representation across the brain, underscoring the inadequacy of solely considering neuronal activities when examining information representation of the brain.

Abstract Inhibitory control is a critical executive function that allows animals to suppress their impulsive behavior in order to achieve certain goals or avoid punishment. We investigated norepinephrine (NE) and acetylcholine (ACh) dynamics and population neuronal activity in the prefrontal cortex during inhibitory control. Using fluorescent sensors to measure extracellular levels of NE and ACh, we simultaneously recorded the dynamics of prefrontal NE and ACh in mice performing an inhibitory control task. The prefrontal NE and ACh signals exhibited strong coherence at 0.4-0.8 Hz. Chemogenetic inhibition of locus coeruleus (LC) neurons that project to the basal forebrain region reduced inhibitory control performance to chance levels. However, this manipulation did not diminish the difference in NE/ACh signals between successful and failed trials; instead, it abolished the difference in NE-ACh phase synchrony between the successful and failed trials, indicating that NE-ACh phase synchrony is a task-relevant neuromodulatory feature. Chemogenetic inhibition of cholinergic neurons that project to the LC region did not impair the inhibitory control performance, nor did it abolish the difference in NE-ACh phase synchrony between successful or failed trials, further confirming the relevance of NE-ACh phase synchrony to inhibitory control. To understand the possible effect of NE-ACh synchrony on prefrontal population activity, we employed Neuropixels to record from the prefrontal cortex with and without inhibiting LC neurons that project to the basal forebrain during inhibitory control. The LC inhibition reduced the number of prefrontal neurons encoding inhibitory control. Demixed principal component analysis (dPCA) further revealed that population firing patterns representing inhibitory control were impaired by the LC inhibition. Disparities in NE-ACh phase synchrony relevant to inhibitory control occurred only in the prefrontal cortex, but not in the parietal cortex, somatosensory cortex, and the somatosensory thalamus. Taken together, these findings suggest that the LC modulates inhibitory control through its collective effect with cholinergic systems on population activity in the prefrontal cortex. Our results further revealed that NE-ACh phase synchrony is a critical neuromodulatory feature with important implications for cognitive control.

Dopamine (DA) plays multiple roles in a wide range of physiological and pathological processes via a vast network of dopaminergic projections. To fully dissect the spatiotemporal dynamics of DA release in both dense and sparsely innervated brain regions, we developed a series of green and red fluorescent GPCR activation-based DA (GRABDA) sensors using a variety of DA receptor subtypes. These sensors have high sensitivity, selectivity, and signal-to-noise properties with subsecond response kinetics and the ability to detect a wide range of DA concentrations. We then used these sensors in freely moving mice to measure both optogenetically evoked and behaviorally relevant DA release while measuring neurochemical signaling in the nucleus accumbens, amygdala, and cortex. Using these sensors, we also detected spatially resolved heterogeneous cortical DA release in mice performing various behaviors. These next-generation GRABDA sensors provide a robust set of tools for imaging dopaminergic activity under a variety of physiological and pathological conditions.

Even under spontaneous conditions and in the absence of changing environmental demands, awake animals alternate between moments of increased alertness and moments of torpor or disengagement. These changes in brain state can occur rapidly, on a timescale of seconds, and may be correlated with overt changes in exploratory behaviors (walking and whisking) or they may be more covert, with no external correlates except for changes in pupil size. Neuromodulators such as acetylcholine (ACh) are thought to play an important role in driving these spontaneous state transitions, and cholinergic activity in cortex has been monitored via calcium imaging of cholinergic axons and with new genetically-encoded fluorescent neuromodulator sensors. Here, we perform the first simultaneous imaging of sensors and axons in vivo, to examine the spatiotemporal properties of cortical acetylcholine (ACh) release during spontaneous changes in behavioral state. As has been previously reported, periods of locomotion were accompanied by large increases in ACh levels across the dorsal cortex, and pupil size tracked smaller, more rapid changes in ACh during periods of quiescence. We observed a high correlation between simultaneously-recorded basal forebrain axon activity and neuromodulator sensor fluorescence. Consistent with volume transmission of ACh, increases in axon activity resulted in increases in local ACh levels that fell off with the distance from the nearest axon. GRAB-ACh fluorescence could be accurately predicted from axonal activity alone, providing the first validation that neuromodulator axon activity is a reliable proxy for nearby neuromodulator levels. To more precisely understand the temporal kinetics of ACh, we applied a deconvolution approach to account for the kinetics of the ACh sensor. Deconvolution of fluorescence traces emphasized the rapid clearance of ACh, especially for smaller transients outside of running periods. Finally, we trained a predictive model of ACh fluctuations from the combination of pupil size and running speed; this model performed better than using either variable alone, and generalized well to unseen data. Overall, these results contribute to a growing understanding of the precise timing and spatial characteristics of cortical ACh during fast brain state transitions under spontaneous conditions.