The nucleolus and other ribonucleoprotein (RNP) bodies are membrane-less organelles that appear to assemble through phase separation of their molecular components. However, many such RNP bodies contain internal subcompartments, and the mechanism of their formation remains unclear. Here, we combine in vivo and in vitro studies, together with computational modeling, to show that subcompartments within the nucleolus represent distinct, coexisting liquid phases. Consistent with their in vivo immiscibility, purified nucleolar proteins phase separate into droplets containing distinct non-coalescing phases that are remarkably similar to nucleoli in vivo. This layered droplet organization is caused by differences in the biophysical properties of the phases—particularly droplet surface tension—which arises from sequence-encoded features of their macromolecular components. These results suggest that phase separation can give rise to multilayered liquids that may facilitate sequential RNA processing reactions in a variety of RNP bodies.PaperClip/cms/asset/27fe82b3-2b23-461b-9ead-a08a6e4e0673/mmc8.mp3Loading ...(mp3, 2.63 MB) Download audio

Summary

 Proteins such as FUS phase separate to form liquid-like condensates that can harden into less dynamic structures. However, how these properties emerge from the collective interactions of many amino acids remains largely unknown. Here, we use extensive mutagenesis to identify a sequence-encoded molecular grammar underlying the driving forces of phase separation of proteins in the FUS family and test aspects of this grammar in cells. Phase separation is primarily governed by multivalent interactions among tyrosine residues from prion-like domains and arginine residues from RNA-binding domains, which are modulated by negatively charged residues. Glycine residues enhance the fluidity, whereas glutamine and serine residues promote hardening. We develop a model to show that the measured saturation concentrations of phase separation are inversely proportional to the product of the numbers of arginine and tyrosine residues. These results suggest it is possible to predict phase-separation properties based on amino acid sequences.

The functions of intrinsically disordered proteins (IDPs) are governed by relationships between information encoded in their amino acid sequences and the ensembles of conformations that they sample as autonomous units. Most IDPs are polyampholytes, with sequences that include both positively and negatively charged residues. Accordingly, we focus here on the sequence–ensemble relationships of polyampholytic IDPs. The fraction of charged residues discriminates between weak and strong polyampholytes. Using atomistic simulations, we show that weak polyampholytes form globules, whereas the conformational preferences of strong polyampholytes are determined by a combination of fraction of charged residues values and the linear sequence distributions of oppositely charged residues. We quantify the latter using a patterning parameter κ that lies between zero and one. The value of κ is low for well-mixed sequences, and in these sequences, intrachain electrostatic repulsions and attractions are counterbalanced, leading to the unmasking of preferences for conformations that resemble either self-avoiding random walks or generic Flory random coils. Segregation of oppositely charged residues within linear sequences leads to high κ -values and preferences for hairpin-like conformations caused by long-range electrostatic attractions induced by conformational fluctuations. We propose a scaling theory to explain the sequence-encoded conformational properties of strong polyampholytes. We show that naturally occurring strong polyampholytes have low κ -values, and this feature implies a selection for random coil ensembles. The design of sequences with different κ -values demonstrably alters the conformational preferences of polyampholytic IDPs, and this ability could become a useful tool for enabling direct inquiries into connections between sequence–ensemble relationships and functions of IDPs.

Not too sticky There is increasing evidence for a role of liquid-liquid phase separation (LLPS) in many cellular processes. Many proteins that undergo LLPS include prionlike domains (PLDs), which are enriched in polar amino acids and often interspersed with aromatic residues. Combining experimental data with simulations, Martin et al. quantified concentrations of PLDs in coexisting dilute and dense phases as a function of temperature and show that the phase behavior is determined by the number of aromatic residues and their patterning, with uniform patterning of aromatic residues promoting LLPS and inhibiting aggregation. They developed a sticker-and-spacers model that can predict the phase behavior of PLDs on the basis of their sequence. Science , this issue p. 694

Liquid-liquid phase separation, driven by collective interactions among multivalent and intrinsically disordered proteins, is thought to mediate the formation of membrane-less organelles in cells. Using parallel cellular and in vitro assays, we show that the Nephrin intracellular domain (NICD), a disordered protein, drives intracellular phase separation via complex coacervation, whereby the negatively charged NICD co-assembles with positively charged partners to form protein-rich dense liquid droplets. Mutagenesis reveals that the driving force for phase separation depends on the overall amino acid composition and not the precise sequence of NICD. Instead, phase separation is promoted by one or more regions of high negative charge density and aromatic/hydrophobic residues that are distributed across the protein. Many disordered proteins share similar sequence characteristics with NICD, suggesting that complex coacervation may be a widely used mechanism to promote intracellular phase separation.

Stressed cells shut down translation, release mRNA molecules from polysomes, and form stress granules (SGs) via a network of interactions that involve G3BP. Here we focus on the mechanistic underpinnings of SG assembly. We show that, under non-stress conditions, G3BP adopts a compact auto-inhibited state stabilized by electrostatic intramolecular interactions between the intrinsically disordered acidic tracts and the positively charged arginine-rich region. Upon release from polysomes, unfolded mRNAs outcompete G3BP auto-inhibitory interactions, engendering a conformational transition that facilitates clustering of G3BP through protein-RNA interactions. Subsequent physical crosslinking of G3BP clusters drives RNA molecules into networked RNA/protein condensates. We show that G3BP condensates impede RNA entanglement and recruit additional client proteins that promote SG maturation or induce a liquid-to-solid transition that may underlie disease. We propose that condensation coupled to conformational rearrangements and heterotypic multivalent interactions may be a general principle underlying RNP granule assembly.

Biophysical responses of proteins to stress Much recent work has focused on liquid-liquid phase separation as a cellular response to changing physicochemical conditions. Because phase separation responds critically to small changes in conditions such as pH, temperature, or salt, it is in principle an ideal way for a cell to measure and respond to changes in the environment. Small pH changes could, for instance, induce phase separation of compartments that store, protect, or inactivate proteins. Franzmann et al. used the yeast translation termination factor Sup35 as a model for a phase separation–induced stress response. Lowering the pH induced liquid-liquid phase separation of Sup35. The resulting liquid compartments subsequently hardened into gels, which sequestered the termination factor. Raising the pH triggered dissolution of the gels, concomitant with translation restart. Protecting Sup35 in gels could provide a fitness advantage to recovering yeast cells that must restart the translation machinery after stress. Science , this issue p. eaao5654

Phase transitions of linear multivalent proteins control the reversible formation of many intracellular membraneless bodies. Specific non-covalent crosslinks involving domains/motifs lead to system-spanning networks referred to as gels. Gelation transitions can occur with or without phase separation. In gelation driven by phase separation multivalent proteins and their ligands condense into dense droplets, and gels form within droplets. System spanning networks can also form without a condensation or demixing of proteins into droplets. Gelation driven by phase separation requires lower protein concentrations, and seems to be the biologically preferred mechanism for forming membraneless bodies. Here, we use coarse-grained computer simulations and the theory of associative polymers to uncover the physical properties of intrinsically disordered linkers that determine the extent to which gelation of linear multivalent proteins is driven by phase separation. Our findings are relevant for understanding how sequence-encoded information in disordered linkers influences phase transitions of multivalent proteins.

Intrinsically disordered proteins (IDPs) adopt heterogeneous ensembles of conformations under physiological conditions. Understanding the relationship between amino acid sequence and conformational ensembles of IDPs can help clarify the role of disorder in physiological function. Recent studies revealed that polar IDPs favor collapsed ensembles in water despite the absence of hydrophobic groups--a result that holds for polypeptide backbones as well. By studying highly charged polypeptides, a different archetype of IDPs, we assess how charge content modulates the intrinsic preference of polypeptide backbones for collapsed structures. We characterized conformational ensembles for a set of protamines in aqueous milieus using molecular simulations and fluorescence measurements. Protamines are arginine-rich IDPs involved in the condensation of chromatin during spermatogenesis. Simulations based on the ABSINTH implicit solvation model predict the existence of a globule-to-coil transition, with net charge per residue serving as the discriminating order parameter. The transition is supported by quantitative agreement between simulation and experiment. Local conformational preferences partially explain the observed trends of polymeric properties. Our results lead to the proposal of a schematic protein phase diagram that should enable prediction of polymeric attributes for IDP conformational ensembles using easily calculated physicochemical properties of amino acid sequences. Although sequence composition allows the prediction of polymeric properties, interresidue contact preferences of protamines with similar polymeric attributes suggest that certain details of conformational ensembles depend on the sequence. This provides a plausible mechanism for specificity in the functions of IDPs.