A method for 3D differentiation of human pluripotent stem cells yields brain cortical spheroids with functional neurons and astrocytes. The spheroids can be sliced for imaging and electrophysiological studies. The human cerebral cortex develops through an elaborate succession of cellular events that, when disrupted, can lead to neuropsychiatric disease. The ability to reprogram somatic cells into pluripotent cells that can be differentiated in vitro provides a unique opportunity to study normal and abnormal corticogenesis. Here, we present a simple and reproducible 3D culture approach for generating a laminated cerebral cortex–like structure, named human cortical spheroids (hCSs), from pluripotent stem cells. hCSs contain neurons from both deep and superficial cortical layers and map transcriptionally to in vivo fetal development. These neurons are electrophysiologically mature, display spontaneous activity, are surrounded by nonreactive astrocytes and form functional synapses. Experiments in acute hCS slices demonstrate that cortical neurons participate in network activity and produce complex synaptic events. These 3D cultures should allow a detailed interrogation of human cortical development, function and disease, and may prove a versatile platform for generating other neuronal and glial subtypes in vitro.

The development of the nervous system involves a coordinated succession of events including the migration of GABAergic (γ-aminobutyric-acid-releasing) neurons from ventral to dorsal forebrain and their integration into cortical circuits. However, these interregional interactions have not yet been modelled with human cells. Here we generate three-dimensional spheroids from human pluripotent stem cells that resemble either the dorsal or ventral forebrain and contain cortical glutamatergic or GABAergic neurons. These subdomain-specific forebrain spheroids can be assembled in vitro to recapitulate the saltatory migration of interneurons observed in the fetal forebrain. Using this system, we find that in Timothy syndrome—a neurodevelopmental disorder that is caused by mutations in the CaV1.2 calcium channel—interneurons display abnormal migratory saltations. We also show that after migration, interneurons functionally integrate with glutamatergic neurons to form a microphysiological system. We anticipate that this approach will be useful for studying neural development and disease, and for deriving spheroids that resemble other brain regions to assemble circuits in vitro. Human pluripotent stem cells were used to develop dorsal and ventral forebrain 3D spheroids, which can be assembled to study interneuron migration and to derive a functionally integrated forebrain system with cortical interneurons and glutamatergic neurons. GABAergic neurons play important roles in brain function and are implicated in numerous psychiatric disorders. They migrate long distances from the ventral to the dorsal forebrain before integrating to cortical circuits. In vitro modelling of GABAergic neuronal differentiation during this interaction would allow us to investigate the cause of human brain disorders associated with defects in neuronal migration, but this has so far been difficult. Sergiu Paşca and colleagues have developed an approach for generating neural three-dimensional spheroids resembling either the ventral or dorsal forebrain. They show that assembling the two types of spheroids separately in vitro allows the saltatory migration of human interneurons into the cortex, as seen in human development, and the formation of functional synapses with the dorsally derived cortical glutamatergic neurons. In this context, they find that interneurons from Timothy syndrome patients exhibit perturbation in migration patterns. Elsewhere in this issue, Paola Arlotta and colleagues carried out single cell expression analysis on cells from human brain organoids to investigate the nature of cells generated by these three-dimensional models.

AAV vectors that efficiently transduce the mouse brain after intravenous injection are generated with a CRE-dependent selection system. Recombinant adeno-associated viruses (rAAVs) are commonly used vehicles for in vivo gene transfer1,2,3,4,5,6. However, the tropism repertoire of naturally occurring AAVs is limited, prompting a search for novel AAV capsids with desired characteristics7,8,9,10,11,12,13. Here we describe a capsid selection method, called Cre recombination–based AAV targeted evolution (CREATE), that enables the development of AAV capsids that more efficiently transduce defined Cre-expressing cell populations in vivo. We use CREATE to generate AAV variants that efficiently and widely transduce the adult mouse central nervous system (CNS) after intravenous injection. One variant, AAV-PHP.B, transfers genes throughout the CNS with an efficiency that is at least 40-fold greater than that of the current standard, AAV9 (refs. 14,15,16,17), and transduces the majority of astrocytes and neurons across multiple CNS regions. In vitro, it transduces human neurons and astrocytes more efficiently than does AAV9, demonstrating the potential of CREATE to produce customized AAV vectors for biomedical applications.

Timothy syndrome is a neurodevelopmental disease that includes autism-like features. Using iPS-derived neurons from individuals with Timothy syndrome, Ricardo Dolmetsch and his colleagues identify changes in cortical neuron fate and neurotransmitter expression that may begin to explain the neural mechanisms that underlie this disorder. Monogenic neurodevelopmental disorders provide key insights into the pathogenesis of disease and help us understand how specific genes control the development of the human brain. Timothy syndrome is caused by a missense mutation in the L-type calcium channel Cav1.2 that is associated with developmental delay and autism1. We generated cortical neuronal precursor cells and neurons from induced pluripotent stem cells derived from individuals with Timothy syndrome. Cells from these individuals have defects in calcium (Ca2+) signaling and activity-dependent gene expression. They also show abnormalities in differentiation, including decreased expression of genes that are expressed in lower cortical layers and in callosal projection neurons. In addition, neurons derived from individuals with Timothy syndrome show abnormal expression of tyrosine hydroxylase and increased production of norepinephrine and dopamine. This phenotype can be reversed by treatment with roscovitine, a cyclin-dependent kinase inhibitor and atypical L-type–channel blocker2,3,4. These findings provide strong evidence that Cav1.2 regulates the differentiation of cortical neurons in humans and offer new insights into the causes of autism in individuals with Timothy syndrome.

There is significant need to develop physiologically relevant models for investigating human astrocytes in health and disease. Here, we present an approach for generating astrocyte lineage cells in a three-dimensional (3D) cytoarchitecture using human cerebral cortical spheroids (hCSs) derived from pluripotent stem cells. We acutely purified astrocyte-lineage cells from hCSs at varying stages up to 20 months in vitro using immunopanning and cell sorting and performed high-depth bulk and single-cell RNA sequencing to directly compare them to purified primary human brain cells. We found that hCS-derived glia closely resemble primary human fetal astrocytes and that, over time in vitro, they transition from a predominantly fetal to an increasingly mature astrocyte state. Transcriptional changes in astrocytes are accompanied by alterations in phagocytic capacity and effects on neuronal calcium signaling. These findings suggest that hCS-derived astrocytes closely resemble primary human astrocytes and can be used for studying development and modeling disease.

The differentiation of pluripotent stem cells in three-dimensional cultures can recapitulate key aspects of brain development, but protocols are prone to variable results. Here we differentiated multiple human pluripotent stem cell lines for over 100 d using our previously developed approach to generate brain-region-specific organoids called cortical spheroids and, using several assays, found that spheroid generation was highly reliable and consistent. We anticipate the use of this approach for large-scale differentiation experiments and disease modeling. A protocol adapted to xeno- and feeder-free conditions is shown to generate reliable and consistent cortical brain organoids across differentiations and source stem cell lines, making it suitable for disease modeling and other applications.

Neurons in the cerebral cortex connect through descending pathways to hindbrain and spinal cord to activate muscle and generate movement. Although components of this pathway have been previously generated and studied in vitro, the assembly of this multi-synaptic circuit has not yet been achieved with human cells. Here, we derive organoids resembling the cerebral cortex or the hindbrain/spinal cord and assemble them with human skeletal muscle spheroids to generate 3D cortico-motor assembloids. Using rabies tracing, calcium imaging, and patch-clamp recordings, we show that corticofugal neurons project and connect with spinal spheroids, while spinal-derived motor neurons connect with muscle. Glutamate uncaging or optogenetic stimulation of cortical spheroids triggers robust contraction of 3D muscle, and assembloids are morphologically and functionally intact for up to 10 weeks post-fusion. Together, this system highlights the remarkable self-assembly capacity of 3D cultures to form functional circuits that could be used to understand development and disease.

The ability to generate region-specific three-dimensional (3D) models to study human brain development offers great promise for understanding the nervous system in both healthy individuals and patients. In this protocol, we describe how to generate and assemble subdomain-specific forebrain spheroids, also known as brain region–specific organoids, from human pluripotent stem cells (hPSCs). We describe how to pattern the neural spheroids toward either a dorsal forebrain or a ventral forebrain fate, establishing human cortical spheroids (hCSs) and human subpallial spheroids (hSSs), respectively. We also describe how to combine the neural spheroids in vitro to assemble forebrain assembloids that recapitulate the interactions of glutamatergic and GABAergic neurons seen in vivo. Astrocytes are also present in the human forebrain–specific spheroids, and these undergo maturation when the forebrain spheroids are cultured long term. The initial generation of neural spheroids from hPSCs occurs in <1 week, with regional patterning occurring over the subsequent 5 weeks. After the maturation stage, brain region–specific spheroids are amenable to a variety of assays, including live-cell imaging, calcium dynamics, electrophysiology, cell purification, single-cell transcriptomics, and immunohistochemistry studies. Once generated, forebrain spheroids can also be matured for >24 months in culture. Neural differentiation and self-organization of hPSCs are induced by culture in suspension. Neural spheroids are then differentiated into dorsal or ventral forebrain spheroids that can be combined to obtain functionally integrated human assembloids.