Intestinal organoids are complex three-dimensional structures that mimic the cell-type composition and tissue organization of the intestine by recapitulating the self-organizing ability of cell populations derived from a single intestinal stem cell. Crucial in this process is a first symmetry-breaking event, in which only a fraction of identical cells in a symmetrical sphere differentiate into Paneth cells, which generate the stem-cell niche and lead to asymmetric structures such as the crypts and villi. Here we combine single-cell quantitative genomic and imaging approaches to characterize the development of intestinal organoids from single cells. We show that their development follows a regeneration process that is driven by transient activation of the transcriptional regulator YAP1. Cell-to-cell variability in YAP1, emerging in symmetrical spheres, initiates Notch and DLL1 activation, and drives the symmetry-breaking event and formation of the first Paneth cell. Our findings reveal how single cells exposed to a uniform growth-promoting environment have the intrinsic ability to generate emergent, self-organized behaviour that results in the formation of complex multicellular asymmetric structures.

Spatial and temporal organoid control Stem cell–derived organoids form through self-organization and serve as models for organ development, function, and disease, with potential applications in drug development and personalized medicine. However, in the absence of external guidance, developmental processes are stochastic, resulting in variable end products that differ significantly from the native organ. Gjorevski et al . developed approaches for specifying the initial organoid geometry to build intestinal organoids of defined shape, size, and cell distributions, forming structures that are predictable, more similar to normal organs, and reproducible (see the Perspective by Huycke and Gartner). These methods identify symmetry-breaking mechanisms in intestinal morphogenesis and have potential for standardizing organoid-based therapies and facilitating the refinement of mechanistic studies. —BAP

Abstract Intestinal organoids derived from single cells undergo complex crypt-villus patterning and morphogenesis. However, the nature and coordination of the underlying forces remains poorly characterized. Through light-sheet microscopy and mechanical perturbations, we demonstrate that organoid crypt formation coincides with stark lumen volume reduction, which works synergistically with actomyosin-generated crypt apical and villus basal tension to drive morphogenesis. We analyse these mechanical features in a quantitative 3D biophysical model and detect a critical point in actomyosin tensions, above which crypt becomes robust to volume changes. Finally, via single-cell RNA sequencing and pharmacological perturbations, we show that enterocyte-specific expressed sodium/glucose cotransporter modulates lumen volume reduction via promoting cell swelling. Altogether, our study reveals how cell fate-specific changes in osmotic and actomyosin forces coordinate robust organoid morphogenesis. One Sentence Summary Emergence of region-specific cell fates drive actomyosin patterns and luminal osmotic changes in organoid development

Abstract Organoids provide an accessible in-vitro system to mimic the dynamics of tissue regeneration and development. However, long-term live-imaging of organoids remains challenging. Here we present an experimental and image-processing framework capable of turning long-term light-sheet imaging of intestinal organoids into digital organoids. The framework combines specific imaging optimization combined with data processing via deep learning techniques to segment single organoids, their lumen, cells and nuclei in 3D over long periods of time. By linking lineage trees with corresponding 3D segmentation meshes for each organoid, the extracted information is visualized using a web-based “Digital Organoid Viewer” tool allowing unique understanding of the multivariate and multiscale data. We also show backtracking of cells of interest, providing detailed information about their history within entire organoid contexts. Furthermore, we show cytokinesis failure of regenerative cells and that these cells never reside in the intestinal crypt, hinting at a tissue scale control on cellular fidelity.

A growing community is constructing a next-generation file format (NGFF) for bioimaging to overcome problems of scalability and heterogeneity. Organized by the Open Microscopy Environment (OME), individuals and institutes across diverse modalities facing these problems have designed a format specification process (OME-NGFF) to address these needs. This paper brings together a wide range of those community members to describe the cloud-optimized format itself -- OME-Zarr -- along with tools and data resources available today to increase FAIR access and remove barriers in the scientific process. The current momentum offers an opportunity to unify a key component of the bioimaging domain -- the file format that underlies so many personal, institutional, and global data management and analysis tasks.

Summary The human intestinal epithelium is a tissue with rapid turnover. Its complex regenerative process and differentiation trajectories have been challenging to study due to its inaccessibility and lack of temporal sampling. To this end, we developed a workflow to culture adult stem cell-derived human intestinal organoids from single cells to maturation. Extensive characterization of our model system indicated a transient regenerative response, followed by differentiation into all mature cell lineages. This switch is accompanied by a transition between two stem cell states. High-content screening and comparison to in vivo studies revealed that an initial fetal-like state is crucial for achieving successful regeneration, while the subsequent adult-like state is vital for maintaining a balance of cell lineages and continuous support of crypt-morphogenesis. Taken together, this study highlights the extensive plasticity of the intestinal epithelium and paves the way for further studies of human intestinal regeneration and its deregulation in pathologies.

Summary Goblet cells secrete mucin to create a protective mucus layer against invasive bacterial infection and are therefore essential for maintaining intestinal health. However, the molecular pathways that regulate goblet cell function remain largely unknown. Although GPR35 is highly expressed in colonic epithelial cells, its importance in promoting the epithelial barrier is unclear. In this study, we show that epithelial Gpr35 plays a critical role in goblet cell function. In mice, cell type-specific deletion of Gpr35 in epithelial cells but not in macrophages results in goblet cell depletion and dysbiosis, rendering these animals more susceptible to Citrobacter rodentium infection. Mechanistically, scRNA-seq analysis indicates that signaling of epithelial Gpr35 is essential to maintain normal pyroptosis levels in goblet cells. Our work shows that the epithelial presence of Gpr35 is a critical element for the function of goblet cell-mediated symbiosis between host and microbiota.

Abstract The protective and absorptive functions of the intestinal epithelium rely on differentiated enterocytes in the villi. The differentiation of enterocytes is orchestrated by sub-epithelial mesenchymal cells producing distinct ligands along the villus axis, in particular Bmps and Tgfβ. Here we show that individual Bmp ligands and Tgfβ drive distinct enterocytic programs specific to villus zonation. Bmp4 is expressed mainly from the center to the upper part of the villus, and it activates preferentially genes connected to lipid uptake and metabolism. In contrast, Bmp2 is produced by villus-tip mesenchymal cells, and it influences the adhesive properties of villus-tip epithelial cells and the expression of immunomodulators. Hence, Bmp2 promotes the terminal enterocytic differentiation at the villus-tip. Additionally, Tgfβ induces epithelial gene expression programs similar to that triggered by Bmp2. The inhibition of Bmp receptor type I in vivo and using intestinal organoids lacking Smad4 revealed that Bmp2-driven villus-tip program is activated by a canonical Smad-dependent mechanism. Finally, we established an organoid cultivation system that enriches for villus-tip enterocytes and thereby better mimics the cellular composition of the intestinal epithelium. Altogether our data suggest that not only Bmp gradient, but also the activity of individual Bmp drives specific enterocytic programs.

Developmental biology—the study of the processes by which cells, tissues, and organisms develop and change over time—has entered a new golden age. After the molecular genetics revolution in the 80s and 90s and the diversification of the field in the early 21st century, we have entered a phase when powerful technologies provide new approaches and open unexplored avenues. Progress in the field has been accelerated by advances in genomics, imaging, engineering, and computational biology and by emerging model systems ranging from tardigrades to organoids. We summarize how revolutionary technologies have led to remarkable progress in understanding animal development. We describe how classic questions in gene regulation, pattern formation, morphogenesis, organogenesis, and stem cell biology are being revisited. We discuss the connections of development with evolution, self-organization, metabolism, time, and ecology. We speculate how developmental biology might evolve in an era of synthetic biology, artificial intelligence, and human engineering.