Abstract Anterograde intraflagellar transport trains are essential for cilia assembly and maintenance. These trains are formed of 22 IFTA and IFTB proteins that link structural and signalling cargoes to microtubule motors for import into cilia. It remains unknown how the IFTA/B proteins are arranged into complexes and how these complexes polymerise into functional trains. Here, we use in situ cryo-electron tomography and Alphafold2 protein structure predictions to generate the first molecular model of the entire anterograde train. We show how the conformation of both IFTA and IFTB is dependent on lateral interactions with neighbouring repeats, suggesting that polymerization is required to cooperatively stabilize the complexes. The retrograde dynein motor binding site is a composite surface involving multiple IFTB repeats, ensuring that dynein can only form a strong interaction with IFTB upon train assembly. Finally, we reveal how IFTB extends two flexible tethers to maintain a connection with IFTA that can withstand the mechanical stresses present in actively beating cilia. Overall, our findings provide a framework for understanding the fundamental processes that are involved in cilia assembly.

Abstract Cilia and flagella are microtubule doublet based organelles found across the eukaryotic tree of life. Their very high aspect ratio and crowded interior are unfavourable to diffusive transport for their assembly and maintenance. Instead, a highly dynamic system of intraflagellar transport (IFT) trains moves rapidly up and down the cilium. However, the mechanism of how these trains turn around upon reaching the ciliary tip has remained elusive. It has been hypothesized that there exists a dedicated calcium-dependent protein-based machinery at the ciliary tip to mediate this conversion. In this work, we use physical and chemical methods to manipulate IFT in the cilia of the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii to show that no such stationary tip-machinery is required for IFT turnaround. Instead, we demonstrate that the conversion from anterograde to retrograde IFT trains is a calcium independent intrinsic ability of the IFT system.

Abstract Intraflagellar transport (IFT) is a conserved process of cargo transport in cilia that is essential for development and homeostasis in organisms ranging from algae to vertebrates. In humans, variants in genes encoding subunits of the cargo-adapting IFT-A and IFT-B protein complexes are a common cause of genetic diseases known as ciliopathies. While recent progress has been made in determining the atomic structure of IFT-B, little is known of the structural biology of IFT-A. Here, we combined chemical cross-linking mass spectrometry and cryo-electron tomography with AlphaFold2-based prediction of both protein structures and interaction interfaces to model the overall architecture of the monomeric six-subunit IFT-A complex, as well as its polymeric assembly within cilia. We define monomer-monomer contacts and membrane-associated regions available for association with transported cargo, and we also use this model to provide insights into the pleiotropic nature of human ciliopathy-associated genetic variants in genes encoding IFT-A subunits. Our work demonstrates the power of integration of experimental and computational strategies both for multi-protein structure determination and for understanding the etiology of human genetic disease. Summary The 3D structure of the six-subunit complex and its polymeric assembly gives insights into cargo transport in cilia and how specific mutations in these genes lead to ciliopathy birth defects.

Abstract The cilium is an antenna-like organelle that performs numerous cellular functions, including motility, sensing, and signaling. The base of the cilium contains a selective barrier that regulates the entry of large intraflagellar transport (IFT) trains, which carry cargo proteins required for ciliary assembly and maintenance. However, the native architecture of the ciliary base and the process of IFT train assembly remain unresolved. Here, we use in situ cryo-electron tomography to reveal native structures of the transition zone region and assembling IFT trains at the ciliary base. We combine this direct cellular visualization with ultrastructure expansion microscopy to describe the front-to-back stepwise assembly of IFT trains: IFT-B forms the backbone, onto which IFT-A, then dynein-1b, and finally kinesin-2 sequentially bind before entry into the cilium. One Sentence Summary Native molecular structure of the ciliary transition zone and hierarchical order of IFT assembly visualized within Chlamydomonas cells.

Abstract CRISPR/Cas genome engineering in the unicellular green algal model Chlamydomonas reinhardtii has until now only been applied to targeted gene disruption, whereas scar-less knock-in transgenesis has generally been considered infeasible. We have developed highly efficient homology-directed knock-in mutagenesis in cell-walled strains of Chlamydomonas . Our method allows scarless integration of fusion tags and sequence modifications of near arbitrary proteins without need for a preceding mutant line.

Yeast cells, when exposed to stress, can enter a protective state in which cell division, growth and metabolism are downregulated. They remain viable in this state until nutrients become available again. How cells enter this protective survival state and what happens at a cellular and subcellular level is largely unknown. In this study, we used electron tomography to investigate the stress-induced ultrastructural changes in the cytoplasm of yeast cells. After ATP depletion, we observed a significant cytosolic compaction and an extensive cytoplasmic reorganization, as well as the emergence of distinct membrane-bound and membrane-less organelles. By using correlative light and electron microscopy (CLEM), we further demonstrate that one of these membrane-less organelles is generated by the reversible polymerization into large bundles of filaments of the eukaryotic translation initiation factor 2B (eIF2B), an essential enzyme in the initiation of protein synthesis. The changes we observe are part of a stress-induced survival strategy, allowing yeast cells to save energy, protect proteins from degradation, and inhibit protein functionality by forming assemblies of said proteins.

Primary cilia are sensory organelles present in many cell types. Based on an array of microtubules termed axoneme they form a specialized membrane compartment partaking in various signaling processes. Primary cilia of pancreatic islet beta cells play a role in autocrine and paracrine signaling and are linked to diabetes. Yet, the structural basis for their functions is unclear. We present three-dimensional reconstructions of complete mouse and human beta cell cilia, revealing a disorganized 9+0 axoneme structure. Within the islet cilia are spatially confined within deep ciliary pockets or squeezed into narrow extracellular spaces between adjacent cells. Beta and alpha cell cilia physically interact with neighboring islet cells pushing and strongly bending their plasma membranes. Furthermore, beta cells can contain multiple cilia that can meet with other islet cell cilia in the extracellular space. Additionally, beta cell cilia establish connections with islet-projecting nerves. These findings highlight the pivotal role of beta cell primary cilia in islet cell connectivity, pointing at their potential functional role in integrating islet intrinsic and extrinsic signals. These novel insights contribute to understanding their significance in health and diabetes.

Apical projections are integral functional units of epithelial cells. Microvilli and stereocilia are cylindrical apical projections that are formed of bundled actin. Microridges on the other hand, grow laterally long, forming labyrinthine patterns on surfaces of various kinds of squamous epithelial cells. So far, the structural organization and functions of microridges have remained elusive. We have analyzed microridges on zebrafish epidermal cells using confocal and electron microscopy methods including electron tomography, to show that a microridge is formed of a network of F-actin and requires the function of the Arp2/3 complex for its maintenance. During development, microridges begin as F-actin punctae showing signatures of branching and requiring an active Arp2/3 complex. Using inhibitors of actin polymerization and the Arp2/3 complex, we show that microridges organize the surface glycan layer. Our analyses have unraveled the F-actin organization supporting the most abundant and evolutionarily conserved apical projection, which functions in glycan organization.

Cells exposed to starvation have to adjust their metabolism to conserve energy and protect themselves. Protein synthesis is one of the major energy-consuming processes and as such has to be tightly controlled. The mechanism by which starved cells regulate the process of protein synthesis is largely unknown. Here, we report that the essential translation initiation factor eIF2B forms filaments in starved budding yeast cells. We demonstrate that filamentation is triggered by starvation-induced acidification of the cytosol, which is caused by an influx of protons from the extracellular environment. We show that filament assembly by eIF2B is necessary for rapid and efficient downregulation of translation. Importantly, this mechanism does not require the kinase Gcn2. Furthermore, analysis of site-specific variants of eIF2B suggests that eIF2B assembly results in enzymatically inactive filaments that promote stress survival and fast recovery of cells from starvation. We propose that translation regulation through protein assembly is a widespread mechanism that allows cells to adapt to fluctuating environments.

Assembly and function of cilia rely on the continuous transport of ciliary components between the cell body and the ciliary tip. This is performed by specialized molecular machines, known as Intraflagellar Transport (IFT) trains. Anterograde IFT trains are powered by kinesin-2 motors and move along the B-tubules (enriched in detyrosinated tubulin) of the ciliary microtubule doublets. Conversely, retrograde IFT trains are moved by dynein-1b motors along the A-tubules (enriched in tyrosinated tubulin) back to the cell body. The segregation of oppositely directed trains on A-tubules or B-tubules is thought to prevent traffic jams in the cilium, but the mechanism by which opposite polarity trains are sorted onto either tubule, and whether tubulin tyrosination/detyrosination plays a role in that process, is unknown. Here, we show that CRISPR-mediated knock-out of VashL, the enzyme that detyrosinates microtubules, causes recurrent stoppages of IFT trains and reduces the rate of ciliary growth in Chlamydomonas reinhardtii. To test whether the observed stoppages, potentially caused by collisions between oppositely directed IFT trains, are ascribable to direct interactions between IFT trains and tubulin tyrosination/detyrosination, we developed methods to reconstitute the motility of native IFT trains from cilia on de-membranated axonemes and ex vivo on synthetically polymerized microtubules. We show that anterograde trains have higher affinity for detyrosinated microtubules (analogous to B-tubules), while retrograde trains for tyrosinated microtubules (analogous to A-tubules). We conclude that tubulin tyrosination/detyrosination is required for the spatial segregation of oppositely directed trains and for their smooth uninterrupted motion. Our results provide a model for how the tubulin code governs molecular transport in cilia.