Abstract The Long-read RNA-Seq Genome Annotation Assessment Project Consortium was formed to evaluate the effectiveness of long-read approaches for transcriptome analysis. Using different protocols and sequencing platforms, the consortium generated over 427 million long-read sequences from complementary DNA and direct RNA datasets, encompassing human, mouse and manatee species. Developers utilized these data to address challenges in transcript isoform detection, quantification and de novo transcript detection. The study revealed that libraries with longer, more accurate sequences produce more accurate transcripts than those with increased read depth, whereas greater read depth improved quantification accuracy. In well-annotated genomes, tools based on reference sequences demonstrated the best performance. Incorporating additional orthogonal data and replicate samples is advised when aiming to detect rare and novel transcripts or using reference-free approaches. This collaborative study offers a benchmark for current practices and provides direction for future method development in transcriptome analysis.

Abstract Gene fusions are important cancer drivers and drug targets, but are difficult to reliably identify with short-read RNA-sequencing. Long-read RNA sequencing data are more likely to span a fusion breakpoint and provide more sequence context around the breakpoint. This allows for more reliable identification of gene fusions and for detecting alternative splicing in gene fusions. Notably, alternative splicing of fusions has been shown to be a mechanism for drug resistance and altered levels of oncogenicity. Here, we present FLAIR-fusion, a computational tool to identify gene fusions and their isoforms from long-read RNA-sequencing data. FLAIR-fusion can detect fusions and their isoforms with high precision and recall, even with error-prone reads. We also investigated different library preparation methods and found that direct-cDNA has a higher incidence of artifactual chimeras than direct-RNA and PCR-cDNA methods. FLAIR-fusion is able to filter these technical artifacts from all of these library prep methods and consistently identify known fusions and their isoforms across cell lines. We ran FLAIR-fusion on amplicon sequencing from multiple tumor samples and cell lines and detected alternative splicing in the previously validated fusion GUCYA2-PIWIL4, which shows that long-read sequencing can detect novel splicing events from cancer gene panels. We also detect fusion isoforms from long-read sequencing in chronic lymphocytic leukemias with the splicing factor mutation SF3B1 K700E , and find that up to 10% of gene fusions had more than one unique isoform. We also compared long-read fusion detection tools with short-read fusion detection tools on the same samples and found greater consensus in the long-read tools. Our results demonstrate that gene fusion isoforms can be effectively detected from long-read RNA-sequencing and are important in the characterization of the full complexity of cancer transcriptomes.

Abstract The Long-read RNA-Seq Genome Annotation Assessment Project (LRGASP) Consortium was formed to evaluate the effectiveness of long-read approaches for transcriptome analysis. The consortium generated over 427 million long-read sequences from cDNA and direct RNA datasets, encompassing human, mouse, and manatee species, using different protocols and sequencing platforms. These data were utilized by developers to address challenges in transcript isoform detection and quantification, as well as de novo transcript isoform identification. The study revealed that libraries with longer, more accurate sequences produce more accurate transcripts than those with increased read depth, whereas greater read depth improved quantification accuracy. In well-annotated genomes, tools based on reference sequences demonstrated the best performance. When aiming to detect rare and novel transcripts or when using reference-free approaches, incorporating additional orthogonal data and replicate samples are advised. This collaborative study offers a benchmark for current practices and provides direction for future method development in transcriptome analysis.

ABSTRACT Genome-wide identification of chromatin organization and structure has been generally probed by measuring accessibility of the underlying DNA to nucleases or methyltransferases. These methods either only observe the positioning of a single nucleosome or rely on large enzymes to modify or cleave the DNA. We developed adduct sequencing (Add-seq), a method to probe chromatin accessibility by treating chromatin with the small molecule angelicin, which preferentially intercalates into DNA not bound to core nucleosomes. We show that Nanopore sequencing of the angelicin-modified DNA is possible and allows visualization and analysis of long single molecules with distinct chromatin structure. The angelicin modification can be detected from the Nanopore current signal data using a neural network model trained on unmodified and modified chromatin-free DNA. Applying Add-seq to Saccharomyces cerevisiae nuclei, we identified expected patterns of accessibility around annotated gene loci in yeast. We also identify individual clusters of single molecule reads displaying different chromatin structure at specific yeast loci, which demonstrates heterogeneity in the chromatin structure of the yeast population. Thus, using Add-seq, we are able to profile DNA accessibility in the yeast genome across long molecules. GRAPHICAL ABSTRACT