ABSTRACT Ribosome profiling (Ribo-seq) has catalyzed a paradigm shift in our understanding of the translational ‘vocabulary’ of the human genome, discovering thousands of translated open reading frames (ORFs) within long non-coding RNAs and presumed untranslated regions of protein-coding genes. However, reference gene annotation projects have been circumspect in their incorporation of these ORFs due to uncertainties about their experimental reproducibility and physiological roles. Yet, it is indisputable that certain Ribo-seq ORFs make stable proteins, others mediate gene regulation, and many have medical implications. Ultimately, the absence of standardized ORF annotation has created a circular problem: while Ribo-seq ORFs remain unannotated by reference biological databases, this lack of characterisation will thwart research efforts examining their roles. Here, we outline the initial stages of a community-led effort supported by GENCODE / Ensembl, HGNC and UniProt to produce a consolidated catalog of human Ribo-seq ORFs.

ABSTRACT Understanding how genetic variants impact molecular phenotypes is a key goal of functional genomics, currently hindered by reliance on a single haploid reference genome. Here, we present the EN-TEx resource of personal epigenomes, for ∼25 tissues and >10 assays in four donors (>1500 open-access functional genomic and proteomic datasets, in total). Each dataset is mapped to a matched, diploid personal genome, which has long-read phasing and structural variants. The mappings enable us to identify >1 million loci with allele-specific behavior. These loci exhibit coordinated epigenetic activity along haplotypes and less conservation than matched, non-allele-specific loci, in a fashion broadly paralleling tissue-specificity. Surprisingly, they can be accurately modelled just based on local nucleotide-sequence context. Combining EN-TEx with existing genome annotations reveals strong associations between allele-specific and GWAS loci and enables models for transferring known eQTLs to difficult-to-profile tissues. Overall, EN-TEx provides rich data and generalizable models for more accurate personal functional genomics.

Abstract The Long-read RNA-Seq Genome Annotation Assessment Project Consortium was formed to evaluate the effectiveness of long-read approaches for transcriptome analysis. Using different protocols and sequencing platforms, the consortium generated over 427 million long-read sequences from complementary DNA and direct RNA datasets, encompassing human, mouse and manatee species. Developers utilized these data to address challenges in transcript isoform detection, quantification and de novo transcript detection. The study revealed that libraries with longer, more accurate sequences produce more accurate transcripts than those with increased read depth, whereas greater read depth improved quantification accuracy. In well-annotated genomes, tools based on reference sequences demonstrated the best performance. Incorporating additional orthogonal data and replicate samples is advised when aiming to detect rare and novel transcripts or using reference-free approaches. This collaborative study offers a benchmark for current practices and provides direction for future method development in transcriptome analysis.

Ribosome profiling (Ribo-seq) has proven transformative for our understanding of the human genome and proteome by illuminating thousands of non-canonical sites of ribosome translation outside of the currently annotated coding sequences (CDSs). A conservative estimate suggests that at least 7,000 non-canonical open reading frames (ORFs) are translated, which, at first glance, has the potential to expand the number of human protein-coding sequences by 30%, from ∼19,500 annotated CDSs to over 26,000. Yet, additional scrutiny of these ORFs has raised numerous questions about what fraction of them truly produce a protein product and what fraction of those can be understood as proteins according to conventional understanding of the term. Adding further complication is the fact that published estimates of non-canonical ORFs vary widely by around 30-fold, from several thousand to several hundred thousand. The summation of this research has left the genomics and proteomics communities both excited by the prospect of new coding regions in the human genome, but searching for guidance on how to proceed. Here, we discuss the current state of non-canonical ORF research, databases, and interpretation, focusing on how to assess whether a given ORF can be said to be "protein-coding".The human genome encodes thousands of non-canonical open reading frames (ORFs) in addition to protein-coding genes. As a nascent field, many questions remain regarding non-canonical ORFs. How many exist? Do they encode proteins? What level of evidence is needed for their verification? Central to these debates has been the advent of ribosome profiling (Ribo-seq) as a method to discern genome-wide ribosome occupancy, and immunopeptidomics as a method to detect peptides that are processed and presented by MHC molecules and not observed in traditional proteomics experiments. This article provides a synthesis of the current state of non-canonical ORF research and proposes standards for their future investigation and reporting.Combined use of Ribo-seq and proteomics-based methods enables optimal confidence in detecting non-canonical ORFs and their protein products.Ribo-seq can provide more sensitive detection of non-canonical ORFs, but data quality and analytical pipelines will impact results.Non-canonical ORF catalogs are diverse and span both high-stringency and low-stringency ORF nominations.A framework for standardized non-canonical ORF evidence will advance the research field.

The application of ribosome profiling has revealed an unexpected abundance of translation in addition to that responsible for the synthesis of previously annotated protein-coding regions. Multiple short sequences have been found to be translated within single RNA molecules, both within annotated protein-coding and non-coding regions. The biological significance of this translation is a matter of intensive investigation. However, current schematic or annotation-based representations of mRNA translation generally do not account for the apparent multitude of translated regions within the same molecules. They also do not take into account the stochasticity of the process that allows alternative translations of the same RNA molecules by different ribosomes. There is an need for formal representations of mRNA complexity that would enable the analysis of quantitative information on translation and more accurate models for predicting the phenotypic effects of genetic variants affecting translation. To address this, we developed a conceptually novel abstraction that we term Ribosome Decision Graphs (RDGs). RDGs represent translation as multiple ribosome paths through untranslated and translated mRNA segments. We termed the later "translons". Non-deterministic events, such as initiation, re-initiation, selenocysteine insertion or ribosomal frameshifting are then represented as branching points. This representation allows for an adequate representation of eukaryotic translation complexity and focuses on locations critical for translation regulation. We show how RDGs can be used for depicting translated regions, analysis of genetic variation and quantitative genome-wide data on translation for characterisation of regulatory modulators of translation.

Significant efforts have been made to characterize the biophysical properties of proteins. Small proteins have received less attention because their annotation has historically been less reliable. However, recent improvements in sequencing, proteomics, and bioinformatics techniques have led to the high-confidence annotation of small open reading frames (smORFs) that encode for functional proteins, producing smORF-encoded proteins (SEPs). SEPs have been found to perform critical functions in several species, including humans. While significant efforts have been made to annotate SEPs, less attention has been given to the biophysical properties of these proteins. We characterized the distributions of predicted and curated biophysical properties, including sequence composition, structure, localization, function, and disease association of a conservative list of previously identified human SEPs. We found significant differences between SEPs and both larger proteins and control sets. Additionally, we provide an example of how our characterization of biophysical properties can contribute to distinguishing protein-coding smORFs from non-coding ones in otherwise ambiguous cases.

Abstract In a 2018 paper posted to bioRxiv, Pertea et al. presented the CHESS database, a new catalog of human gene annotations that includes 1,178 new protein-coding predictions. These are based on evidence of transcription in human tissues and homology to earlier annotations in human and other mammals. Here, we reanalyze the evidence used by CHESS, and find that nearly all protein-coding predictions are false positives. We find that 86% overlap transposons marked by RepeatMasker that are known to frequently result in false positive protein-coding predictions. More than half are homologous to only nine Alu -derived primate sequences corresponding to an erroneous and previously withdrawn Pfam protein domain. The entire set shows poor evolutionary conservation and PhyloCSF protein-coding evolutionary signatures indistinguishable from noncoding RNAs, indicating lack of protein-coding constraint. Only four predictions are supported by mass spectrometry evidence, and even those matches are inconclusive. Overall, the new protein-coding predictions are unsupported by any credible experimental or evolutionary evidence of function, result primarily from homology to genes incorrectly classified as protein-coding, and are unlikely to encode functional proteins.

The acceleration of DNA sequencing in patients and population samples has resulted in unprecedented catalogues of human genetic variation, but the interpretation of rare genetic variants discovered using such technologies remains extremely challenging. A striking example of this challenge is the existence of disruptive variants in dosage-sensitive disease genes, even in apparently healthy individuals. Through manual curation of putative loss of function (pLoF) variants in haploinsufficient disease genes in the Genome Aggregation Database (gnomAD)( [1][1] ), we show that one explanation for this paradox involves alternative mRNA splicing, which allows exons of a gene to be expressed at varying levels across cell types. Currently, no existing annotation tool systematically incorporates this exon expression information into variant interpretation. Here, we develop a transcript-level annotation metric, the proportion expressed across transcripts (pext), which summarizes isoform quantifications for variants. We calculate this metric using 11,706 tissue samples from the Genotype Tissue Expression project( [2][2] ) (GTEx) and show that it clearly differentiates between weakly and highly evolutionarily conserved exons, a proxy for functional importance. We demonstrate that expression-based annotation selectively filters 22.8% of falsely annotated pLoF variants found in haploinsufficient disease genes in gnomAD, while removing less than 4% of high-confidence pathogenic variants in the same genes. Finally, we apply our expression filter to the analysis of de novo variants in patients with autism spectrum disorder (ASD) and developmental disorders and intellectual disability (DD/ID) to show that pLoF variants in weakly expressed regions have effect sizes similar to those of synonymous variants, while pLoF variants in highly expressed exons are most strongly enriched among cases versus controls. Our annotation is fast, flexible, and generalizable, making it possible for any variant file to be annotated with any isoform expression dataset, and will be valuable for rare disease diagnosis, rare variant burden analyses in complex disorders, and curation and prioritization of variants in recall-by-genotype studies. [1]: #ref-1 [2]: #ref-2

Transcriptional profiling of hematopoietic cell subpopulations has helped characterize the developmental stages of the hematopoietic system and the molecular basis of malignant and non-malignant blood diseases for the past three decades. The introduction of high-throughput RNA sequencing has increased knowledge of the full repertoire of RNA molecules in hematopoietic cells of different types, without relying on prior gene annotation. Here, we introduce the analysis of the BLUEPRINT consortium gene expression data for mature hematopoietic cells, comprising 90 total RNA and 32 small RNA sequencing experiments, from 27 different cell types. We used these data to describe the transcriptional profile of each cell type at the gene and isoform level using existing gene annotations. Moreover, we used guided transcriptome assembly to extend the annotation of the transcribed genome, which led to the identification of hundreds of novel non-coding RNA genes, which display a high degree of cell type specificity. We also characterized the expression of circular RNAs and found that these are also highly cell type specific. This resource refines the active transcriptional landscape of mature hematopoietic cells, highlights abundant genes and transcriptional isoforms for each cell type, and provides valuable data and visualisation tools for the scientific community working on hematological development and diseases.

Major urinary proteins (MUP) are the major component of the urinary protein fraction in house mice (Mus spp.) and rats (Rattus spp.). The structure, polymorphism and functions of these lipocalins have been well described in the western European house mouse (Mus musculus domesticus), clarifying their role in semiochemical communication. The complexity of these roles in the mouse raises the question of similar functions in other rodents, including the Norway rat, Rattus norvegicus. Norway rats express MUPs in urine but information about specific MUP isoform sequences and functions is limited. In this study, we present a detailed molecular characterization of the MUP proteoforms expressed in the urine of two laboratory strains, Wistar Han and Brown Norway, and wild caught animals, using a combination of manual gene annotation, intact protein mass spectrometry and bottom-up mass spectrometry-based proteomic approaches. Detailed sequencing of the proteins reveals a less complex pattern of primary sequence polymorphism than the mouse. However, unlike the mouse, rat MUPs exhibit added complexity in the form of post-translational modifications including phosphorylation and exoproteolytic trimming of specific isoforms. The possibility that urinary MUPs may have different roles in rat chemical communication than those they play in the house mouse is also discussed.